β—羟基—β—甲基丁酸对衰老小鼠腓肠肌蛋白质合成的影响研究

尤莉蓉 赵艳 尚画雨 孟思进 史仍飞 夏志

摘 要：探索膳食添加β-羟基-β-甲基丁酸（HMβ）对衰老小鼠骨骼肌蛋白质合成的调节作用及其作用机理。方法：16月龄雄性C57BL/6J小鼠24只随机纳入3个处理组：膳食添加HMβ组、添加等氮剂量丙氨酸组及空白对照组，其中HMβ组小鼠和丙氨酸组小鼠饲料中分别添加4.5% HMβ和3.4%丙氨酸，空白对照组则饲以国家标准维持饲料，共计干预8周。期间记录各组小鼠体质量与采食量，测量小鼠后肢的最大抓握力。各组小鼠于末次饲食后禁食12 h，麻醉后摘眼球采血处死，移除腓肠肌外侧头浅层白肌并称重。测定骨骼肌蛋白质总量、肌原纤维与肌浆蛋白含量且免疫印迹检测MHCⅡ、mTORSer2448、p70s6kThr389和4EBP1Thr37/46磷酸化表達的组间差异。结果：膳食添加4.5%剂量的HMβ未显著影响衰老小鼠体重与采食量，但可见腓肠白肌湿重、湿重/体重校正比值增加，且增幅具有统计学意义；腓肠白肌蛋白质总量、肌原纤维与肌浆蛋白质含量及MHCⅡ总量表达均显著增长；mTORSer2448、p70s6kThr389与4EBP1Thr37/46磷酸化水平亦有明显上调。结论：膳食添加4.5%比例HMβ具有促进骨骼肌蛋白质合成，削弱衰老性骨骼肌萎缩与功能衰退的重要潜力，其作用机理可能涉及mTOR/p70s6k/4EBP1信号转导通路的活化。

关键词：β-羟基-β-甲基丁酸；肌少症；蛋白质合成；功能衰退；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

中图分类号：G 804.7 学科代码：040302 文献标识码：A

Abstract：Objective： To investigate the effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate （HMβ） supplementation on protein synthesis in aged mice and preliminarily explore the possible mechanism of action. Method： Twenty four C57BL/6J male mouse， 16-month old， were randomly allocated to three groups： HMβ supplementation， isonitrogenous alanine supplementation and blank control group. Mice in HMβ and alanine group were treated with standard chow diet supplemented with 4.5% HMβ and 3.4% alanine respectively for 8 weeks， while blank control group were fed with normal diet. Both body weight and food intake were recorded during research， the maximal grip strength of lateral limb was also determined. Twelve hours of fasting after the last feeding， mice exposed to anesthesia and then sacrificed via drawing blood. The white gastrocnemius muscle was removed and weighed. The total protein， myofibrillar and sarcoplasmic protein content in white gastrocnemius were determined， and the phosphorylation of mTORSer2448， p70s6kThr389and 4EBP1Thr37/46 was also measured using western blotting. Results： Both body weight and food intake of aged mice were not significantly influenced by dietary HMβ supplementation. The wet weight of white gastrocnemius， and re-adjusted ratio of white gastrocnemius to body weight were significantly improved. The total protein， myofibrillar and sarcoplasmic protein content， and expression of MHCⅡ were greatly increased. Furthermore， the phosphorylation rate of mTORSer2448，p70s6kThr389 and 4EBP1Thr37/46 were also found to be elevated significantly. Conclusion： Dietary HMβ supplementation with 4.5% dosage was capable of promoting muscular protein synthesis， and thus it has the potential to attenuate age-related skeletal muscle atrophy and functional decline. In terms of the possible mechanism， the mTOR/p70s6k/4EBP1 signaling pathway may be directly or at least to some extent involved in this process.

Keywords：HMβ；sarcopenia； protein synthesis； functional decline； mTOR

肌少症（sarcopenia，SP）是一种随年龄增长而出现的骨骼肌病理性变化，主要表现为骨骼肌量的进行性减少与功能衰退，在老龄人群中其发生率可超过30%[1]。SP过程中快缩型骨骼肌萎缩性变化明显，患者生活质量与身心健康多受到严重影响，可能因此而出现摔倒、残疾等意外伤害甚至导致死亡，是老龄人群所面临的重要威胁之一。随着我国社会老龄化进程的不断发展，老龄人口日益增长，SP的发生、发展与患者医疗费用的增长直接相关，目前SP已成为影响健康老龄化的重大社会问题，对我国公共医疗开支与社会经济也形成了较为沉重的负担[2]；因此，加强对SP干预措施的研究，制订合理且有针对性的干预方案，对于改善老龄人群骨骼肌功能状态，促进健康老龄化目标的顺利实现具有重要意义。

蛋白质代谢平衡的紊乱是诱发骨骼肌萎缩的根本原因[3]，就SP而言则主要因蛋白质合成的减少所致[4]。亮氨酸被认为是骨骼肌蛋白质合成的有力营养刺激，已有此前的相关研究也证实以5%比例进行膳食亮氨酸添加可有效促进老龄小鼠骨骼肌蛋白质合成，抑制衰老所致骨骼肌萎缩[5-7]；但近期有个别研究认为，亮氨酸代谢中间产物β-羟基-β-甲基丁酸（β-hydroxy-β-methylbutyrate，HMβ）可能更适于作为干预SP的营养手段。其原因有二：一方面，HMβ与亮氨酸相比能以更低的剂量产生更显著的促蛋白质正性平衡作用[8]；另一方面，以高剂量进行亮氨酸补充可能促进肿瘤生长，从而限制了其在恶性肿瘤高危老年人群中的应用[9]。就HMβ而言，目前学界多认为其对骨骼肌蛋白质代谢的调节作用主要集中于削弱降解方面的潜力；因此，对于恶病质与长期卧床等消耗状态下的骨骼肌萎缩可能具有较好的干预效果，但其究竟能否通过促进衰老骨骼肌蛋白质合成而发挥保护作用，迄今仍无定论。鉴于此，本研究拟在前期关于亮氨酸的研究基础上，观察膳食添加等氮剂量HMβ对衰老小鼠快缩型骨骼肌蛋白质合成与肌力的影响，评价其在预防衰老性骨骼肌萎缩和功能衰退方面的潜力，并通过观察调节蛋白质合成的关键信号通路的表达变化，初步探讨HMβ可能的作用原理。

1 研究方法

1.1 实验法

1）实验对象及分组。16月龄C57BL/6J雄性小鼠24只，体质量（48.6±0.9） g，由南京鹏晟生物有限公司提供。单笼饲养，自由摄食、饮水，室温（22±1.5） ℃，光照12 h。区间分组法据体质量随机纳入空白对照组（N）、膳食添加丙氨酸对照组（A）与膳食添加HMβ组（H），每组8只。

2）饲料配制。已有研究表明，5%亮氨酸可有效促进骨骼肌蛋白質正性平衡，对于衰老骨骼肌具有积极的保护作用[5-7]。本研究中采用与5%亮氨酸等氮剂量的HMβ（纯度95%）来添加。具体方法为：以普通国标维持饲料为底料，沿袭替换等量玉米粉的方法，在H组小鼠饲料内添加4.5%比例HMβ，A组小鼠饲料中仍添加3.4%非必需氨基酸丙氨酸，配为等氮对照饲料，以使各组饲料的粗蛋白基本一致。H组饲料的消化能、粗蛋白、钙、总磷与有效磷含量分别为14.57 MJ/kg、24.3%（质量比）、1.26%（质量比）、1.15%（质量比）与0.91%（质量比），氨基酸检测如图1所示。各组实验动物饲料的氨基酸含量见表1。

3）实验方案。参考已有研究方法[5-7]，N组小鼠饲喂底料，H组饲喂HMβ添加料，A组饲喂添加丙氨酸的等氮饲料，每周称量3次并记录采食量，干预8周后处死取材。

4）主要仪器与试剂。主要仪器：美国Thermo MultiSkan3型酶标仪、美国Bio-Rad电泳仪、北京凯元Mini P-4电泳槽、济南益延科技YLS-13A大小鼠抓握力计。主要试剂：常规试剂均购自国家标准物质中心或国药集团化学试剂公司。食品级HMβ购自靖江市三益化工有限公司，丙氨酸购自上海生工公司（AD0022）。蛋白提取试剂与蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司（78510、23235或23200），蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche公司（11836153001），mTOR总量与Ser2448位点磷酸化一抗（5536S、2983S）、p70s6k总量与Thr389位点磷酸化一抗（2708S、9234S）、4EBP1总量与Thr37/46位点磷酸化一抗（2855S、9644S）购自北京赛信通公司，Ⅱ肌球蛋白重链（MHCⅡ）总量抗体一抗（Ab51263）购自上海艾博抗公司，HRP标记二抗购自美国Jackson公司（115-035-003、111-035-003），蛋白Marker购自立陶宛Fermentas公司（SM6210）。

5）取材。各组小鼠在取材前禁食过夜，饮水不限。取材日0.3 mL/（100 g ）剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后摘眼球采血。常规分离血清与血浆后分装保存待测。快速分离腓肠肌外侧头白肌，液氮速冻后置超低温冰箱保存待测。

6） 测试方法。

①肌原纤维与肌浆蛋白定量。肌原纤维与肌浆蛋白含量测定参考Koopman等[10]的研究，肌样在5%预冷缓冲液（0.25 mol/L蔗糖、2 mmol/L EDTA与10 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl）中匀浆后600g离心20 min，收集含肌原纤维蛋白的沉降物，上清于4 ℃ 100 000g离心60 min分离肌浆蛋白。采用Bradford法进行蛋白定量：吸取0、0.01、0.02、0.04和0.05 mL 1 mg/mL BSA于比色管内，加入0.1、0.09、0.08、0.06、0.04、0.02和0 mL生理盐水后加入5 mL考马斯亮蓝，混匀静置20 min，595 nm波长测定OD值。循此法取0.01 mL蛋白样本与0.09 mL生理盐水及等量考马斯亮蓝混匀静置后测定OD值。据OD值计算蛋白含量。

②蛋白表达分析。Western blotting测定蛋白表达，方法同已有研究[5-7]：肌样加入蛋白提取试剂后剪成1～2 mm3碎粒并匀浆，4 ℃ 10 000g离心20 min后取上清。蛋白定量后以每次上样120 μg的标准分装，PBS补足20 μL。加入5X上样缓冲液5 μL后煮沸变性。配制5%浓缩胶与15%分离胶，浓缩胶80 V恒压30～40 min，分离胶120 V恒压，溴酚蓝至板底后停止。湿转法转膜，恒流300 mA，MHCⅡ表达的转膜2.5 h，稀释比1∶3 000；mTOR表达转膜2 h，稀释比均为1∶1 000；p70s6k表达转膜1 h，总量与磷酸化表达稀释比分别为1∶2 000与1∶500；4EBP1表达转膜0.5 h，稀释比均为1∶1 000。

③肌肉功能评价。采用小鼠后肢抓握力评价骨骼肌功能。根据已有的经验，16月龄小鼠每周肌力变化并不显著，因此，本研究中在正式干预前测定基础值，此后每2周重复测量一次。测试时用静脉输液管套住小鼠前爪使其不能抓握，提起鼠尾使其后肢抓紧测力板金属抓握杆，缓慢水平向后拉动，双侧后肢若同时松开则记录显示器数值。每只小鼠视测试表现重复6～10次，以最大值为准。

1.2 数理统计法

应用SPSS 13.0软件进行统计学处理。体质量与平均采食量指标采用Repeated measures ANOVA进行统计分析，不满足球对称时，参照Greenhouse-Geisse校正结果。对各组动物组内各时点值进行多重比较时，若校正系数Epsilon<0.7时采用Bonferroni法进行置信区间校正。其他指标均采用One-way ANOVA进行统计分析，组间多重比较也参照Bonferroni校正的结果。P≤0.05时，认为差异具有统计学意义。

2 研究结果

2.1 体质量

实验期内小鼠体质量变化如图2所示。重复测量方差分析结果显示：球形检验P<0.01，不满足球对称，需采用校正后结果进行判断。其中时间因素的主效应显著（F=15.736，P<0.01），提示各组小鼠体质量在实验周期内均具有随时间而变化的趋势；组内各时点间多重比较的Bonferroni校正结果表明N组与H组小鼠各时点体质量未见显著差异，仅N组小鼠第4、7、8周体质量较第2周有显著升高，P值分别为0.038、0.021、0.029。分组因素（F=2.076，P=0.151）与交互效应（time×group，F=0.962，P=0.453）均未具统计学意义，提示不同处理未导致各组小鼠体质量产生具有统计学意义的差异，各时点组间多重比较结果亦未见显著差异。

2.2 采食量

实验期内小鼠采食量變化如图3所示。重复测量方差分析结果显示：球形检验P=0.032，采用校正后结果判断。时间（F=0.1761，P=0.130）、分组（F=0.794，P=0.465）因素的主效应及两因素的交互效应（F=0.399，P=0.966）均未见统计学意义，提示各组小鼠平均采食量在整个实验周期内未见显著变化，不同处理也未对其采食量造成明显影响。组内各时间点多重比较与组间各时点采食量多重比较结果也未见具有统计学意义的差异。

2.3 处死前体质量与腓肠白肌重

如图4A所示，单因素方差分析结果显示各组小鼠处死前体质量组间差异未见统计学意义（F=1.428，P=0.262）。如图4B所示，腓肠白肌湿重组间差异具有统计学意义（F=3.332，P=0.050），组间多重比较结果也表明H组（157.8±10.4）小鼠腓肠白肌湿重显著高于N组（149.0±8.4）与A组（147.9±5.6），P值分别为0.049与0.028。腓肠白肌湿重与体质量比值如图4C所示，方差分析结果表明组间差异具有统计学意义（F=4.354，P=0.026），多重比较结果也显示H组（0.33±0.019）比值显著高于N组（0.30±0.023）与A组（0.31±0.016），P值分别为0.010与0.047。

2.4 骨骼肌蛋白质总量、肌原纤维与肌浆蛋白质含量

如图5A所示，腓肠白肌蛋白总量组间差异具有统计学意义（F=7.206，P=0.004），组间多重比较结果也表明H组（43.3±2.2）小鼠蛋白总量显著高于N组（38.5±3.7）与A组（39.0±2.2），P值分别为0.007与0.017。如图5B所示，肌原纤维蛋白含量组间差异具有统计学意义（F=19.655，P=0.000），组间多重比较结果也表明H组（39.8±1.4）小鼠蛋白总量显著高于N组（32.8±2.5）与A组（32.1±3.8），P值均为0.000。肌浆蛋白含量如图5C所示，H组（35.3±2.8）含量显著高于N组（30.1±2.2）与A组（30.5±1.4），P值均为0.001。

2.5 肌力

实验期内小鼠抓握力变化如图6所示。重复测量方差分析结果显示：球形检验P=0.000，采用校正后结果判断。除分组因素之外（F=0.128，P=0.880），时间（F=23.347，P=0.000）因素的主效应及两因素的交互效应（F=65.545，P=0.000）均具有统计学意义，提示各组小鼠的抓握力量在整个实验周期内具有显著变化，但不同处理也未导致显著的组间差异。然而，对不同时点各组间组小鼠抓握力进行比较发现，第8周时H组小鼠肌力（126.6±14.4）与N组（115.4±13.9）与A组（116.7±10.6）的差异接近临界P值，分别为0.054与0.062。对各组小鼠不同时点抓握力的纵向比较发现，较初始值而言，N组（P=0.018，P=0.000）与A组（P=0.012，P=0.000）小鼠第6、8周肌力显著降低，而H组则表现为增强（P=0.036，P=0.003）。

2.6 促蛋白质合成信号通路蛋白表达

如图7A所示，H组（1.94±0.27）小鼠mTORSer2448磷酸化率较N组与A组上调，P值均为0.001，差异具有统计学意义；如图7B所示，H组（2.20±0.44）p70s6kThr389磷酸化率同样较N组与A组小鼠上调，P值均为0.002，差异也具有统计学意义；如图7C所示，H组（2.01±0.37）4EBP1Thr37/46磷酸化水平较2个对照组升高，具有统计学意义（P=0.002）；就MHCⅡ（2.46±0.25）蛋白表达而言，H组亦较N组与A组增高，增幅具有统计学意义（P=0.000）。

3 讨论

本研究在前期关于亮氨酸干预效果的研究基础上[5-7]，使用小鼠国标维持饲料为底料，采用等量替换玉米粉的形式，以与5%亮氨酸等氮（粗蛋白）的剂量进行了HMβ添加，剂量经等氮换算为4.5%。就对照组而言，循常规设立了等氮对照组与空白对照组，其中等氮组同样采用了3.4%比例的α-丙氨酸添加。α-丙氨酸作为一种可以快速代谢的非必需氨基酸，已被证实不影响骨骼肌蛋白质合成，常作为氨基酸营养研究中的等氮处理手段[6]。通过本研究的实验组饲料氨基酸检测结果可见，饲料配制是完全满足本研究需要的。而关于研究期内体质量与平均每日采食量的变化结果也表明，以4.5%剂量添加HMβ并未显著改变小鼠正常生长性能与平均采食量，进一步佐证了以国标维持料作为底料进行的HMβ或丙氨酸添加的可取性。

衰老骨骼肌蛋白质合成水平的变化是本研究所关注的科学问题。本研究通过骨骼肌湿质量、骨骼肌湿质量/终末体质量百分比，骨骼肌蛋白质总量、肌原纤维蛋白质含量、肌浆蛋白质含量，以及骨骼肌蛋白质合成关键信号通路蛋白功能表达水平3个方面的适应性变化建立评价指标体系，分别从组织、分子和蛋白质3个层面对不同处理手段对衰老骨骼肌蛋白质合成代谢所造成的影响进行了探讨。就组织重量的变化而言，添加HMβ导致腓肠白肌湿重较对照组呈增加趋势，且增幅具有统计学意义。由于同月龄小鼠的骨骼肌量可能受到体质量的直接影响，因此，采用各组小鼠处死前体质量对腓肠白肌湿重进行了校正，结果也观察到了具有统计学意义的组间差异。提示HMβ组小鼠腓肠白肌较进行等氮干预的丙氨酸组和空白对照组小鼠出现了适应性肥大，与前人的相关研究结果一致。Gerlinger-Romero等[11]最近的一项动物实验表明，给成年大鼠以320 mg/kg剂量强饲HMβ共计28 d，可致趾长伸肌湿重较安慰剂对照大鼠出现显著增长。而Vukovich等[12 ] 早期采用老年人体被试所进行的研究也观察到，膳食添加HMβ的被试较对照组在第8周时呈现出显著的瘦体质量增长。

由于小鼠骨骼肌量较小，而本研究中所使用的腓肠白肌仅为腓肠肌外侧头浅层白色部分；因此，在取材时难以避免的误差可能会对本研究结果造成混杂影响。基于此进而检测了不同处理组中骨骼肌蛋白质含量的差异。作为蛋白质合成水平的直接评价指标，骨骼肌蛋白质总量、肌原纤维蛋白质含量及肌浆蛋白质含量可以更为直观、准确地揭示蛋白质合成的变化趋势。数据表明：无论是蛋白质总量还是肌原纤维或肌浆蛋白质含量，均表现出了显著的组间差异，且添加HMβ组小鼠的蛋白质水平较对照组高。在目前的参考文献中，Flummer等[13]给仔猪饲料中添加HMβ[15 mg Ca（HMβ）2/kg]28 d发现，实验组仔猪的蛋白质含量显著高于安慰剂对照动物，也与本研究所观察到的结果一致。骨骼肌是机体最为重要的蛋白质存储池，不仅有50%～75%的机体蛋白质储备于骨骼肌内，且这一储备直接受到骨骼肌蛋白质合成与降解平衡的动态调节；因此，保持这一平衡对于预防萎缩、维护代谢健康至关重要[14]。如前所述，SP发生与发展的重要特点及根本原因在于蛋白质合成量的减少，因此，腓肠肌蛋白质总量与肌原纤维、肌浆蛋白含量的增多提示膳食添加HMβ可能具有改善SP的重要潜力。

调节骨骼肌蛋白质合成的信号转导通路不仅是探讨各种干预手段作用机制的重要靶点，同时也可作为蛋白质代谢水平的间接指示，通路中关键调控蛋白的功能表达变化同样能够反映蛋白质合成的上调或下调趋势。前期的研究表明，衰老骨骼肌蛋白质合成的调节机制也以mTOR为中心，合成代谢刺激可通过mTOR介导直接控制翻译的起始与延伸；因此，在蛋白质合成调节方面发挥重要作用[5-7]。此前也有研究证实，特异性阻断mTOR的功能表达将抑制95%的适应性肌肉肥大[15]。mTOR下游靶蛋白在蛋白质合成调节过程中也具有重要作用，其中p70s6k可磷酸化rPS6并进而控制含有5-末端寡聚嘧啶的mRNAs的翻译效率。4EBP1的磷酸化则调节eIF4F复合物的装配，对于帽依赖性翻译的起始具有重要作用；因此，就衰老骨骼肌蛋白质代谢而言，mTOR/p70s6k/4EBP1信号转导通路的活化也被视为蛋白质合成增加的间接表现。本研究中观察到，膳食添加HMβ组小鼠mTORSer2448、p70s6kThr389與4EBP1Thr37/46的蛋白质磷酸化率较等氮与空白对照组小鼠均有显著上调，提示该组小鼠腓肠白肌蛋白质合成增加，且表明该通路在HMβ调节衰老骨骼肌蛋白质合成过程中也具有重要作用。Eley等[16]对C2C12肌管细胞给予50 mM HMβ孵育，发现显著刺激了细胞蛋白质合成，这一反应与mTOR及其下游靶蛋白4EBP1与p70s6k的磷酸化呈正性相关，且可以为mTOR抑制剂雷帕霉素所阻断，这一结果较好地佐证了mTOR/p70s6k/4EBP1信号转导通路在调节骨骼肌蛋白质合成中的贡献。但是，HMβ究竟通过何种途径调节这一信号通路？迄今仍不清楚。就MHCⅡ蛋白表达而言，由于SP主要表现为快缩型骨骼肌的变化，而快缩型骨骼肌纤维类型及收缩表型由Ⅱ型相对表达所决定；因此，MHCⅡ的表达变化也对骨骼肌蛋白质合成水平有间接指示作用。本研究中补充HMβ导致小鼠腓肠白肌内MHCII的表达显著上调，进一步反映了蛋白质合成反应的增强。

除上述骨骼肌蛋白質合成评价指标体系之外，肌肉力量的增长可在一定程度上反映机体同化作用的增强。就HMβ对肌力的影响而言，本研究观察到膳食添加HMβ使小鼠抓握力从第4周开始呈上升趋势，至第6周时即已表现出显著的增长，而等氮与空白对照组小鼠肌力则呈相反变化趋势，在第6周时较实验前有明显下降。尽管实验末次测试的小鼠最大抓握力仍未见显著组间差异，但组内纵向比较的结果仍然足以说明HMβ对衰老骨骼肌肌力的保护作用。前人探讨HMβ促力作用时，肌力变化多作为一项重点关注指标。Payne等[17]以杜氏肌肉营养不良模型小鼠为研究对象，发现补充8周HMβ可增强小鼠抓握力并延长抓握耐力，且肌肉丢失得到缓解。Noh等[18]给经地塞米松处理的大鼠以150或600 mg/kg剂量灌胃HMβ 5 d，发现肌肉丢失与握力下降均受到抑制。Park等[19]以0.5 g/kg剂量给接受能量限制（-30%）的小鼠施加HMβ干预6周，也观察到抓握力与腓肠肌量的增长。可见，HMβ在多种肌肉萎缩条件下均可对肌肉质量和肌肉力量产生保护作用。而Vallejo等[20]近期以19月龄小鼠为研究对象，以514 mg/kg剂量补充HMβ 8周，同样发现肌肉功能衰退受到明显抑制，进一步佐证了HMβ在改善SP小鼠肌力方面的作用潜力。

就HMβ通过刺激骨骼肌蛋白质合成改善骨骼肌萎缩与功能衰退的作用而言，相关研究结果目前仍有分歧[21]。作为亮氨酸的中间代谢产物，HMβ经亮氨酸代谢生成比例仅为5%左右，既然亮氨酸的营养促力作用已达成共识，则关于HMβ研究结果的矛盾从理论上而言可能仍源自于干预剂量与干预周期的差异。Rossi等[22]最近研究发现老年人群每日需摄入高达60 g亮氨酸以满足机体对HMβ的需求量。本研究是在前期亮氨酸相关研究的基础上采用等氮剂量进行HMβ膳食添加，而5%剂量亮氨酸被认为有助于血浆亮氨酸达到维持骨骼肌细胞内外最佳比例的水平，加之研究对象为自然衰老小鼠，8周干预周期相对较为充足，从而能够产生积极的干预效果。从这一角度看，其应用可能仍需要临床转化医学领域的深入研究。此外，基于上述线索，不难理解HMβ与亮氨酸相比为何能以较小剂量而发挥更为显著的效果，但两者调节衰老骨骼肌蛋白质合成作用的异同仍有待进一步比较予以明确。

4 结束语

以4.5%剂量膳食添加HMβ可促进快缩型骨骼肌蛋白质总量、肌原纤维与肌浆蛋白质含量增多，MHCⅡ蛋白表达上调，骨骼肌湿重增长及肌肉力量增加，具有促进衰老骨骼肌蛋白质合成、预防和延缓衰老性骨骼肌萎缩与功能衰退的重要潜力，其作用机理可能涉及mTOR/p70s6k/4EBP1信号转导通路的活化。但HMβ激活该通路的具体途径即mTOR的上游调控蛋白目前仍不清楚，其较亮氨酸在调节骨骼肌蛋白质合成方面的作用有何差异亦需明确，这些问题仍有待进一步研究。

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