人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用

张慧华 姜新华 方水晶

[摘要] 目的 探讨人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用。 方法 采用羊肉汤二倍稀释法测定人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用。 结果 本次研究共得44株标准株，其中阳性被膜菌株31例，被膜形成率为70.45%，编号为SA17的为强成膜菌株，MIC标准菌株20株，强成膜株SA17 41株；MBC标准菌株30株，强成膜株SA17 60株。药物浓度3.2/1.6时，金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。药物浓度100、50、25、12.5、6.3时金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。人参皂苷能下调agr、sarA、fnbA基因表达，其中0.1、1.0、10.0浓度下调agr、sarA、fnbA基因表达，与对照相比，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜具有显著的抑制作用，随着药物浓度的增加，其抑制率显著增加。人参皂苷可下调agr、sarA、fnbA基因表达，减少细菌黏附性。

[关键词] 人参皂苷；金黄色葡萄球菌；生物被膜；抑制

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）22-0016-03

[Abstract] Objective To explore the inhibitory effect of ginsenoside on bacterial biofilm of Staphylococcus aureus. Methods The inhibitory effect of ginsenoside on Staphylococcus aureus biofilm was detected by two times dilution method of mutton soup. Results In this study， 44 standard strains were obtained， of which 31 cases were positive membrane strains. The membrane formation rate was 70.45%. Strong membrane strains were numbered SA17. There were 20 MIC standard strains and 41 strong membrane strains SA17. There were 30 MBC standard strains， and 60 strong membrane strains SA17. There was significant difference in inhibition rates of Staphylococcus aureus biofilm（P<0.05） when drug concentration was 3.2/1.6， while there was no significant difference in inhibition rates of Staphylococcus aureus biofilm（P>0.05） when drug concentration was 100， 50， 25， 12.5 and 6.3. Ginsenoside could reduce the expression of gene agr， sarA and fnbA， and the expressions of gene agr， sarA， fnbA， when the concentrations of ginsenoside were at 0.1， 1.0 and 10.0， were different from those of the control（P<0.05）， which were significantly different. Conclusion Ginsenoside has a significant inhibitory effect on Staphylococcus aureus biofilm， and the inhibition rate increases as the drug concentration rises. Ginsenoside can reduce the expressions of gene agr， sarA and fnbA， and decrease bacterial adhesion.

[Key words] Ginsenoside； Staphylococcus aureus； Biofilm； Inhibition

人參，微寒，属于五加科人参属植物。祖国传统中医认为，在治疗感染性疾病时可加入人参，起到强身健体、提高抵抗力的作用。现代药理学研究证实[1]，人参皂苷能抑制蛋清所致的大鼠足肿胀，提高肾上腺。金黄色葡萄球菌是一种革兰阳性杆菌，分布较广，具有危险致病性，约有30%[2]健康人群携带该病菌。金黄色葡萄球菌可引起机体感染，并加剧病情。生物被膜是细菌细胞为适应环境变化，形成多聚物质包裹并附着于生物体或分生物体表面的多层细菌构成体。临床共识生物被膜是细菌保护膜。85%金黄色葡萄球菌感染患者[3]可能形成生物被膜，并可出现持续性细菌感染，产生抗药性。抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成是一种预防措施，目前对抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的研究主要集中在化学抑制剂及生长条件限制方面。金黄色葡萄球菌生物被膜最佳生长温度为37℃，蔗糖及低浓度的氯化钠能促进金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。环式双鸟苷酸能抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成，但抑制效果较差。本文主要探讨人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

人参皂苷购于浙江亚克药业有限公司，国食健字G20060157，执行标准YBZ11372009，规格0.125 g/粒，共60粒。肉汤购于生物制品药品检定所（M-H肉汤），药敏试验所用材料购于夏斯生物技术有限公司。

1.2 方法

药敏试验：应用试管二倍稀释法进行药敏试验，试用药物人参皂苷，以肉汤培养基溶解，制成40 μmol/L溶液，经30 min培养，适应0.22 μm过滤膜过滤，除去杂质及细菌。使用肉汤进行二倍稀释，40、20、10、5.0、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0 mg/mL，将每次浓度体积设为4 mL，拟定3个平行，取对数生长期金黄色葡萄球菌菌液以肉汤稀释（100倍），作为本次研究的接种溶液。在每个试管内加入0.1 mL接种溶液，加入人参皂苷，放于37℃培养22 h，待试管内溶液已经完全澄清，立即测定OD600与只加菌，并与未加入药物的试管内溶液测定值进行比较。

1.3评价指标

生物被膜：应用结晶紫染色法测定，将一定数量的接种溶液（3 mL）置于96孔板中，严格按照生物被膜测定步骤及方法进行，每株菌3个复孔，取平均值。阴性株菌标准：OD595 nm≤0.11；弱成膜菌株标准：0.11～0.5 OD595 nm（含0.5 OD595 nm）；中成膜菌株标准：0.5～1.5 OD595 nm（含1.5 OD595 nm）；强成膜菌株标准：>1.5OD595 nm；实验菌选择标准：强阳性菌株SA17。药物最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）：加放人参皂苷的溶液与阴性对照一样清晰透明为人参皂苷的MIC，与阴性对照一样清晰的药物接种溶液再次接種血琼脂培养基培养24 h，以无细菌生长的含量最少溶液作为金黄色葡萄球菌的MBC。

人参皂苷最小抑膜浓度（sMIC）测定：（OD阴性对照组-OD药物组）/（OD阴性对照组-OD空白组）×100%。

纤粘连蛋白黏附：应用PeacokSJ（2000）法对纤粘连蛋白黏附进行检测，吸附值（A）=（每孔的实际吸收值-阴性对照孔的实际吸收值）×100%。

1.4统计学方法

本研究所有研究数据及资料均由参与人员共同收集完成，数据由3名数据处理经验丰富的工作人员独立录入Epidata3.1软件，并进行校对；所有数据采用SPSS19.00软件进行统计分析，计数资料以（%）表示，样本构成比采用χ2检验，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义，检验标准为α=0.05。

2 结果

2.1 临床菌株生物被膜检测结果

本次研究共得44株标准株，其中阳性被膜菌株31例，被膜形成率为70.45%，编号为SA17的为强成膜菌株，MIC标准菌株20株，强成膜株SA17 41株；MBC标准菌株30株，强成膜株SA17 60株。

2.2不同人参皂苷浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用

分析发现，药物浓度3.2/1.6时对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。药物浓度100、50、25、12.5、6.3时金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3人参皂苷对预培养细菌基因表达量的影响

研究结果显示，人参皂苷能够下调agr、sarA、fnbA基因表达，0.1、1.0、10.0浓度下调agr、sarA、fnbA基因表达，与对照相比，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是一种重要的食源性致病菌，具有强大的生物被膜形成能力。细菌附着在生物或非生物接触表面进行生长，从而形成被膜。细菌被膜外基质主要由糖、蛋白质组成，这些物质将细菌包裹，从而形成大量细菌聚集物。生物被膜中的细菌尤其是深层的细菌极不易被杀死或清除，形态结构稳定，生物化学特征明显，增殖与生长缓慢，对各种化学药物的耐受性较高。机会致病菌金黄色葡萄球菌能够寄宿在医疗器械及植入物上面，形成生物被膜，造成慢性感染。目前已能识别金黄色葡萄球菌生物被膜基因。金黄色葡萄球菌生物被膜能造成慢性感染，并影响疾病发展，阻碍疾病康复，还可导致细菌在微环境与宿主之间传播，扩散感染，加重病情。金黄色葡萄球菌生物被膜对抗生素具有极高的耐药性，常规治疗药物作用不佳。因此，以金黄色葡萄球菌生物被膜为靶点的治疗药物，成为相关领域研究的热点问题。目前西医在控制金黄色葡萄球菌生物被膜方面主要有3个措施：（1）去除已经形成的金黄色葡萄球菌生物被膜。（2）杀死金黄色葡萄球菌生物被膜中的微生物，以达到控制金黄色葡萄球菌生物被膜增殖的目的。（3）抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成。事实上，西医一些措施既不能完全除去金黄色葡萄球菌生物被膜，也不能完全杀死金黄色葡萄球菌生物被膜中的微生物。中药历史悠久，对其药理及作用进一步研究有助于中药事业的发展。西药抗生素在治疗感染性疾病中起到重要的作用，但我国抗生素滥用现象严重，易产生耐药性，不利于病情康复。如大环内酯类抗生素虽具有较好的抗生物被膜特性，能快速参与免疫调节，减少感染，成为最常用的抗金黄色葡萄球菌生物被膜药物。但长期服用西药抗生素，依赖性较强，群体效应不佳，还可引起其他革兰阴性相关感染。因此，该采用何种有效药物抗金黄色葡萄球菌生物被膜，预防其他革兰阴性相关感染，成为临床重点研究议题。本文认为，选用具有抗菌作用的中药成份，对临床用药起到重要的意义。单味人参皂苷中药成份具有较好的抑菌作用。人参皂苷Rb1是从五加科中植物人参中提取的一种抑菌物质，该物质能通过抑制金黄色葡萄球菌代谢产热抑制金黄色葡萄球菌能量代谢，从而达到抑制金黄色葡萄球菌的作用。尹良军等[4]认为，人参皂苷具有价格优廉、毒副作用较小、耐药少等优点，能较好的抑制金黄色葡萄球菌增殖。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有多种耐药性，给临床诊治带来困难[5-10]。金黄色葡萄球菌生长至指数后期，菌体到一定浓度后[11-14]agr基因激活，fnb基因表达抑制[15-16]，从而降低金黄色葡萄球菌的黏附能力[17-19]。sar可与基因的启动子结合，激活其转录。sarA对fnb为正向调控。本文研究结果显示，人参皂苷不直接影响金黄色葡萄球菌生长，而是通过减少细胞内活菌数据，下调金黄色葡萄球菌黏附蛋白基因表达。抑制率在药物浓度为3.2 mg/mL 及1.6 mg/mL时有差异（P<0.05），在浓度为100 mg/mL时抑制率最高，抑制率最大，表明不同浓度的人参皂苷对生物被膜的形成具有不同的抑制作用，抑制率随着药物浓度的增加而提高，对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成具有抑制作用有增强趋势。

综上所述，人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成具有抑制作用，随着药物浓度的增加，其抑制作用越强。

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（收稿日期：2018-01-05）