中性蛋白酶催化水解蓝圆鲹提取粗鱼油的工艺条件优化

黄茂坤，汪 泳

蓝圆鲹为暖水性中上层鱼，广泛分布在我国福建省沿岸、海南省东部近海岸等地［1］；其繁殖周期短、生长快、产量大，全国捕捞量可达60多万吨，是我国主要经济鱼类之一［2］.据相关研究报道［3-5］，蓝圆鲹富含多种人体必须氨基酸和不饱和脂肪酸，营养价值高，是优质的海洋鱼类资源.但是，蓝圆鲹肉质松软、肉色暗，离水后极易腐败变质，且捕捞时段又集中在夏季，大量渔获物短期内集中上市［6］，因此极少鲜售，多数加工为咸干制品或饲料，总体加工水平低下，造成资源浪费.近年来，海洋鱼油类产品中因含有多种具有优良生理活性的不饱和脂肪酸而深受消费者青睐，市场需求量越来越大，且该类产品附加值高，可作为实现低值海鱼蓝圆鲹高值化加工利用的有效途径之一.海洋鱼油的加工方法有碱提取、蒸煮提取、蛋白酶酶水解提取、超临界萃取等，其中碱提取、蒸煮提取等传统方法存在鱼油分离效果低、溶剂残留造成环境污染等问题［6-7］.超临界萃取法成本太高，不适合大规模生产.而蛋白酶水解法主要是利用蛋白酶破坏蛋白质与脂肪的结合关系［8］，该方法鱼油分离效果好，无环境污染问题，副产物还可进一步开发氨基酸类产品，易于实现规模化生产，是当前比较实用的鱼油提取方法.

为此，本试验选用中性蛋白酶作为提取蓝圆鲹粗鱼油水解用酶，并对其水解工艺条件进行优化，以期为蓝圆鲹鱼油的开发提取提供初步技术参考.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

新鲜蓝圆鲹（购于泉州市丰泽区仁风菜市场）；中性蛋白酶（食品级，江苏锐阳生物科技有限公司）；氢氧化钠（AR，西陇化工股份有限公司）；盐酸（AR，西陇化工工厂有限公司）；石油醚（AR，沸程30～60℃，西陇化工股份有限公司）；无水乙醇（AR，西陇化工股份有限公司）.

1.2 仪器与设备

AL104-IC型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LXP-10型铝合金绞肉机，永康市益海顺工贸有限公司；L18-Y920型九阳破壁料理机，九阳股份有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TG16-WS型台式高速离心机，湖南湘仪实验仪器制造有限公司；PHS-3C型精密PH计，上海精科有限公司；SHB-Ⅲ磁力搅拌水浴锅，金坛市良友仪器有限公司.

1.3 试验方案

（1）工艺流程.新鲜蓝圆鲹除去内脏，清洗、沥干后冻藏保存→解冻→用绞肉机将鱼绞碎得蓝圆鲹样品→加蓝圆鲹样品等质量的蒸馏水，与样品一起放入料理机匀浆→称取30g匀浆后的蓝圆鲹鱼糜于250ml烧杯中，调节料液比→调节pH值→加入中性蛋白酶→置于磁力搅拌水浴锅恒温酶解→95℃水浴加热处理10min，使中性蛋白酶失活→将酶水解物转移至离心机离心处理（转速7000r/min）10min→取出漂浮于离心液最上层的油状物，用石油醚进行萃取→将溶有油状物的石油醚置于60℃的水浴中，将石油醚蒸干→再置于真空干燥箱中干燥至恒重→粗鱼油.

（2）单因素试验方案.本试验以蓝圆鲹粗鱼油得率为指标，考察酶水解时间、酶水解反应体系初始PH值、酶水解温度、酶添加量、酶水解反应体系料液比5个工艺因素对试验结果的影响，每次进行三组平行试验，结果取三组平行试验所测指标值的平均值，具体方案设计如下：

①酶水解时间的单因素试验方案：固定中性蛋白酶添加量为1%，料液比为1∶3，水解温度为50℃，酶水解反应体系初始pH值为7.0，分别考察中性蛋白酶水解时间为1h、2h、3h、4h、5h、6h对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响，选择出试验结果较好的酶水解时间.

②酶水解反应体系初始pH值的单因素试验方案：固定中性蛋白酶添加量为1%，料液比为1：3，水解温度为50℃，酶水解时间为4h，分别考察酶水解反应体系初始pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响，选择出试验结果较好的酶水解反应体系初始pH值.

③酶水解温度单因素试验方案：固定中性蛋白酶添加量为1%，料液比为1∶3，酶水解时间为4h，酶水解反应体系初始pH值为7.0，分别考察酶水解温度为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响，选择出试验结果较好的酶水解温度.

④酶添加量的单因素试验方案：固定酶水解反应体系料液比为1∶3，酶水解时间为4h，酶水解反应体系初始pH值为7.0，酶水解温度为50℃，分别考察中性蛋白酶添加量为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响，选择出试验结果较好的酶添加量.

⑤酶水解反应体系料液比单因素试验方案：固定酶水解时间为4h，酶水解反应体系初始pH值为7.0，酶水解温度为50℃，酶添加量为2%，分别考察酶水解反应体系料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响，选择出试验结果较好的酶水解反应体系料液比.

（3）正交试验方案.为进一步确定蓝圆鲹粗鱼油提取的最佳工艺条件，综合单因素试验结果，固定酶水解反应体系料液比为1∶3，选择酶水解时间（A）、酶水解反应体系初始pH值（B）、酶水解温度（C）、酶添加量（D）作为试验因子，以蓝圆鲹粗鱼油得率为指标，采用L1（645）的正交试验设计，如表1，优化中性蛋白酶水解蓝圆鲹提取粗鱼油的工艺条件.

表1 L16（45）正交试验因素水平表

1.4 指标测定

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

（1）酶水解时间对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响.以酶水解时间（h）为横坐标，蓝圆鲹粗鱼油得率为纵坐标，绘制酶水解时间与蓝圆鲹粗鱼油得率的关系曲线，结果如图1所示.根据图1可知，中性蛋白酶作用时间在4h内时，蓝圆鲹粗鱼油得率随作用时间的延长而增加，当作用时间超过4h后，蓝圆鲹粗鱼油得率略微下降，且变化趋于稳定，这可能是因为，反应初期中性蛋白酶与反应底物蓝圆鲹充分接触，有效地催化蓝圆鲹蛋白质发生水解反应，破坏了蓝圆鲹样品中脂肪与蛋白质的交联作用，使脂肪分离出来，但随着反应时间的延长，水解产物不断增加，甚至导致水解逆反应的发生，直至整个水解反应趋于平衡，因此，蓝圆鲹粗鱼油得率的变化在反应时间超过4h后会适当回落，并最终趋于稳定.另外，水解时间太长，粗鱼油中的不饱和脂肪酸等成分容易氧化导致所得粗鱼油颜色变深，因此，综合考虑，选择酶解时间4h为后续试验的参考工艺条件.

图1 酶水解时间对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响

（2）酶水解反应体系初始pH值对粗鱼油得率的影响.以蓝圆鲹水解反应体系的初始pH值为横坐标，蓝圆鲹粗鱼油得率为纵坐标，绘制酶水解反应体系初始pH值与蓝圆鲹粗鱼油得率的关系曲线，结果如图2所示.根据图2可知，当水解反应体系的初始pH值为4.0～7.0时，蓝圆鲹粗鱼油得率随着水解反应体系初始pH值的增加而增加，而水解反应体系初始pH值超过7.0后，粗鱼油得率开始有所下降.这是因为，中性蛋白酶有最适催化水解反应pH条件要求，当反应体系初始pH条件不一样时，中性蛋白酶在反应体系中表现出对蓝圆鲹蛋白质的催化水解活性不一样，对蓝圆鲹蛋白质与脂肪结合结构的破坏程度不一样，最终蓝圆鲹粗鱼油得率也会不一样.因此，将酶水解反应体系初始pH值设为7.0，作为后续试验的参考工艺条件.

图2 初始pH值对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响

（3）酶水解温度对粗鱼油得率的影响.以酶水解温度为横坐标，蓝圆鲹粗鱼油得率为纵坐标，绘制酶水解温度与蓝圆鲹粗鱼油得率的关系曲线，结果如图3所示.根据图3可知，蓝圆鲹粗鱼油得率随着水解反应设置温度的提高呈先上升后下降的趋势，最佳的试验结果出现在50℃附近.这是因为，中性蛋白酶有一个最适的催化水解反应温度，当其所处水解反应体系的温度低于其最适催化水解反应温度时，随着反应体系温度的提高，其对蓝圆鲹蛋白质的水解作用逐渐增强，有利于破坏蓝圆鲹蛋白质与脂肪的结合，使脂肪游离出来，提高粗鱼油的得率，相反，当反应体系温度超过其最适反应温度后，继续升高温度反而会使其催化活性降低甚至失活，从而影响试验结果.

图3 酶水解温度对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响

（4）酶添加量对粗鱼油得率的影响.以中性蛋白酶添加量为横坐标，蓝圆鲹粗鱼油得率为纵坐标，绘制酶添加量与蓝圆鲹粗鱼油得率的关系曲图，结果如图4所示.根据图4可知，随着中性蛋白酶添加量的增加，蓝圆鲹粗鱼得率呈逐渐增加的趋势，直至中性蛋白酶添加量超过2%以后，蓝圆鲹粗鱼油得率开始略有下降.这可能是因为中性蛋白酶在发挥催化水解作用时与反应底物有固定的接触位点，其催化水解反应达到最佳效果所需的用量是相对固定的，在低于最佳用量的情况下，提高其添加量，能有效促进蓝圆鲹蛋白质的分解，破坏蛋白质与脂肪的结合结构，提高粗鱼油的得率，但超过其最佳用量，反而可能会因为其自身蛋白质属性而发生自溶，从而影响反应的进行.

图4 酶添加量对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响

（5）酶水解反应体系料液比对粗鱼油得率的影响.以酶水解反应体系反应体系料液比为横坐标，蓝圆鲹粗鱼油得率为纵坐标，绘制料液比与蓝圆鲹粗鱼油得率之间的关系曲线，如图5所示.根据图5可知，随着料液比的减小，蓝圆鲹粗鱼油得率呈先提高后降低的变化趋势.这是因为，料液比的变化会影响蓝圆鲹原料和中性蛋白酶在反应体系中的分散情况，料液比过高时，蓝圆鲹原料在反应体系无法充分分散，不能与中性蛋白酶很好地接触，会影响催化水解反应的进行，导致粗鱼油得率不高；而料液比太低时，又可能导致中性蛋白酶在反应体系中过于分散，减少其与分散在反应体系中蓝圆鲹原料的接触机会，一样会降低粗鱼油得率.

图5 料液比对蓝圆鲹粗鱼油得率的影响

2.2 正交试验结果分析

正交试验结果见表2，试验结果的极差和方差分析结果分别见表3和表4.根据表3可知，影响中性蛋白酶催化水解蓝圆鲹提取粗鱼油的4个工艺因素极大值组合为A2B2C2D3，即最优工艺条件为：酶水解时间4h、酶水解反应体系初始pH值7.0、酶水解温度50℃、酶添加量2.3%.根据表4可知，因素D（酶添加量）对试验结果影响极显著，因素A（酶水解时间）、B（酶水解反应体系初始pH值）、C（酶水解温度）对试验结果影响显著，各因素对试验结果的影响大小为：D（酶添加量）＞A（酶水解时间）＞C酶水解温度）＞B（酶水解反应体系初始pH值）.在酶水解反应体系料液比为1∶3的条件下，采用上述最优工艺条件组合进行验证试验，结果测得蓝圆鲹粗鱼油得率为3.41%.水解处理蓝圆鲹蛋白质制备粗鱼油是蓝圆鲹鱼油开发的正确方向，在后续研究中可继续探索其他蛋白酶在蓝圆鲹鱼油开发中的应用情况，研究出更佳的制备工艺方案，并对制备的粗鱼油进行精制处理，开发出相应产品，为低值海鱼蓝圆鲹的高值化利用提供了技术参考.

表2 正交试验结果

表3 极差分析结果

表4 方差分析结果

3 结论与讨论

本试验采用中性蛋白酶酶水解反应体系料液比1∶3、酶水解时间4h、酶添加量2.3%、酶水解温度50℃、酶水解反应初始pH值7.0的工艺条件水解蓝圆鲹制备粗鱼油的得率为3.41%，与谢燕等［9］测得蓝圆鲹各部位粗脂肪含量为2.1%～3.8%的结果基本吻合，说明采用中性蛋白酶水解法能够较高效地从蓝圆鲹提取出粗鱼油.另外，借鉴白鑫华［10］、衣美艳［11］、骆婷［12］等的研究经验，相较于目前市面上常用的碱水解提取鱼油的方法，蛋白酶水解法不会产生诸如对环境造成污染的碱废弃液等问题，而且蛋白酶解反应条件温和，具有高度的专一性，只通过高效降解原料中的蛋白质分子，释放出包埋于其中的油脂，对其它营养物质几乎无任何破坏作用，特别适用于海洋鱼油的开发利用.因此，本试验采用中性蛋白酶催化