细胞周期蛋白家族基因在家蚕5龄幼虫精巢发育过程中的表达分析

刘丽华，付熙瑶，王嘉阳，刘美琦，单子笑，栾雪红

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态［1］.调控细胞周期的蛋白主要包括细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖激酶（Cyclindependent kinase，CDK）及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（Cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）.其中，Cyclin为正调控蛋白家族，通过依次激活相应的CDK活性，从而推动细胞周期进程［2］.Cyclin广泛存在于多种生物体内［3-4］，在哺乳动物细胞中发现了20多种，在家蚕体内报道了6种，即CyclinA［5］、CyclinB［6］、CyclinB3［6］、CyclinE［7］、CyclinL1［8］、CyclinH［9］.

家蚕是重要的经济昆虫，生殖及发生与家蚕的经济性状密切相关，研究家蚕生殖与分化对蚕种、蚕丝生产具有重要的理论指导意义［10］.家蚕精巢发育是一个极其复杂的生理过程，受到多种因素的调节，包括激素、营养、基因调节等等，同时在此过程中伴随着精子的发生过程，这一过程经历有丝分裂及减数分裂等，最终发育为成熟的精子，在此过程中细胞周期蛋白发挥重要的调控作用.为了从分子水平上探索家蚕精巢与精子发生机制，本文通过检测家蚕精巢在5龄幼虫不同发育时期细胞周期蛋白基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在转录水平上的表达变化，旨在为揭示细胞周期蛋白在家蚕生殖细胞发生过程中的分子机制提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用的家蚕品种是由苏州大学基础医学与生命科学学院蚕桑实验室提供的大造，用桑叶在26℃、湿度65%～75%条件下饲养.分别取家蚕5龄1～8d幼虫精巢冻存于液氮中备用.

1.2 方法

（1）精巢组织总RNA提取及cDNA制备.家蚕5龄1～8d幼虫精巢总RNA提取，按照Trizol-A+试剂盒（TaKaRa公司）说明书进行，测定OD值，检测其浓度和纯度.反转录采用TaKaRa公司的M-MLV反转录试剂盒进行.

（2）实时荧光定量 PCR.CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因、Actin3内参基因的引物设计及实时荧光定量PCR过程均与本文作者刘丽华［11］等相同.

（3）构建标准曲线.用双蒸水以10倍梯度分别将上述基因稀释成6个浓度梯度，进行Realtime PCR，以所得Ct值（循环阈值）为纵坐标，log值（对应的模板拷贝数常用对数）为横坐标制作标准曲线.

（4）数据分析.利用ABI 7300仪器自带的Sequence detection software version 1.3.1软件对检测结果进行分析，并参照 Jan H Schefe［12］的方法进行效率校正.

2 结果

2.1 实时荧光定量反应标准曲线绘制

家蚕细胞周期蛋白家族基因的实时荧光定量PCR标准曲线如图1所示.由图1可知，扩增曲线良好，各曲线相关系数R2均大于0.99，符合定量PCR的要求.

2.2 细胞周期蛋白家族基因在家蚕5龄幼虫精巢不同发育时期的表达

对家蚕5龄幼虫不同发育时期精巢的Cyclin家族基因mRNA转录情况进行检测.结果如图2所示，细胞周期蛋白家族基因在5龄幼虫期都能检测到表达.CyclinB相对转录表达水平远远高于其他成员，而CyclinA相对表达水平较低，并且呈现出逐渐降低的趋势.其他细胞周期蛋白家族基因在5龄2d时，转录表达水平均呈下降趋势，而后逐步上升5d后，则相对表达水平又降低.

图1 家蚕细胞周期蛋白家族基因的实时荧光定量PCR标准曲线

图2 家蚕Cyclin家族基因在5龄幼虫1～8d精巢中的转录特征

3 讨论

在发育生物学中，个体形态建成以及性腺形成是两个非常重要的过程.很多基因在这些过程中起着重要作用，他们相互作用调控着整个发育过程，其中细胞周期蛋白基因起着非常重要的作用.已有研究表明，细胞周期蛋白家族基因在5龄中期各组织的转录水平存在差异，除CyclinE在脂肪体中表达较高外，其他成员都在精巢中表达量最高［12］，说明Cyclin家族基因在家蚕精母细胞形成精子的过程中发挥着重要作用.

本试验在转录水平上对家蚕5龄幼虫Cyclin家族基因在精巢不同发育阶段的表达进行了检测.结果表明，Cyclin家族基因在5龄幼虫精巢不同发育阶段都能检测到表达，但表达水平相差很大.CyclinA相对表达水平较低，并呈现出逐渐降低的趋势，这与家蚕在此期的生长发育特点相关，家蚕生长到3龄末4龄初时，进入成熟期，开始进行减数分裂，第一次减数分裂周期很长，一直持续到4龄末或5龄初才进入中期、后期而完成分裂.有研究证明，CyclinA1只在哺乳动物雄性生殖细胞的第一次减数分裂之前或期间表达［13］，CyclinA1的关键作用是在生精细胞的减数分裂期激活CyclinB，从而使细胞完成G2/M期的转换过程［14］.这与本试验的研究结果相同.CyclinB的转录表达水平远远超过其他成员，已有研究表明，哺乳动物B型周期蛋白在睾丸生殖细胞中表达水平很高［15］，说明CyclinB基因与精母细胞的减数分裂、精细胞的大量形成有密切关系.CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在5龄2d时，转录水平均呈下降趋势，而后逐步上升5d后则相对表达水平下降.表明此期精母细胞成熟分裂即将完成，进入变形期.

精子发生是一个特殊的雄性生殖细胞的分化过程，也是一个特殊的细胞周期运行过程，在此过程中，特定的基因严格按照时间、空间顺序表达.细胞周期蛋白与有丝分裂、减数分裂密切相关，Debra J等研究证实细胞周期蛋白基因在精子发生过程中参与了关键性调控［16］.因此，对细胞周期调控基因的表达研究将为深入了解生精过程的分子机制奠定基础.