铁皮石斛无菌播种成苗体系优化

陈 志，汪一婷，吕永平，牟豪杰，陈剑平，2，*

(1．浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州310021;2．宁波大学植物病毒研究所，浙江宁波315211)

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是传统名贵保健品，野生资源一直处于供不应求的状态。随着铁皮石斛组织培养技术和规模化种植技术的不断发展，越来越多的企业从事铁皮石斛种苗产业化生产和人工种植，其栽培规模有了飞跃式的发展，全国铁皮石斛种植面积达到约5 333 hm2，鲜条产量从2008年的1 200 t迅速增长到2014年的14 800 t，产值也从约3.9亿元增长到约90.8亿元。

20世纪80年代至今，有较多学者对铁皮石斛的组织培养进行了相关的研究和报道，如孙安慈等［1］最早进行了铁皮石斛组培苗生根诱导研究;叶秀粦等［2］对铁皮石斛种子离体萌发进行了报道;张治国等［3］筛选了铁皮石斛原球茎分化培养基;饶宝蓉等［4］利用铁皮石斛种子和茎段分别进行组培研究后认为，利用种子进行无菌培养更有利于铁皮石斛种苗工厂化生产;罗绍强［5］以幼嫩茎段为起始材料进行了铁皮石斛组培快繁体系建立研究;徐玲等［6］研究了不同有机添加物对铁皮石斛组培不同培养阶段的影响，针对原球茎分化、生根阶段筛选了不同的适宜有机添加物;彭文书等［7］利用响应面法优化了铁皮石斛组培生根阶段的培养基;常美花等［8］以带芽茎段为起始材料，进行了铁皮石斛快繁技术体系研究;戴小英等［9］以铁皮石斛种子及茎段为外植体进行组培快繁体系建立研究，认为以茎段建立体系优于种子。但多数研究大多局限于某一阶段，尚未形成系统、可靠的技术体系。

目前，多数铁皮石斛生产主要以种子无菌播种培养为主，从种子播种到出苗培养周期过长，一般为12～14个月，种苗同步化较差。本研究结合生产实际需求，以铁皮石斛种子为起始材料，拟通过对其萌发成苗过程中的接种密度、有机添加物、光照环境等影响因素进行研究，以期缩短种苗培养周期，提高种苗同步化率，服务于铁皮石斛种苗产业化生产。

1 材料与方法

1．1 植物材料

雁荡山铁皮石斛成熟蒴果，由乐清铁枫堂生物科技股份有限公司提供。

1．2 试验灯具

荧光灯(实验室):Philips，TLD 36W/840 cool white;LED白光:3 000 K。

1．3 试验方法

1．3.1 种子准备

在无菌工作台上，将铁皮石斛蒴果进行表面消毒，然后切开3～5个蒴果，将种子混合倒入到一个无菌锥形瓶中，加入15～20 mL MS液体培养基，充分混匀后计数单位体积内种子数量，为后期做准备。

1．3.2 种子播种培养

以直径为9 cm的培养皿为种子培养容器，前期利用M1～M4共4种培养基为基础，设置2 000、5 000和10 000粒·皿－13种不同接种密度进行试验，后期利用M5～M21共17种培养基测试播种密度为8 000粒·皿－1的培养效果，M1～M21培养基成分见表1。培养环境分为光照时间 10 h，光照强度 25 ～ 30 μmol·m－2·s－1和全暗两种环境，培养温度(24±2)℃。

表1 种子萌发阶段测试培养基Table 1 Medium for seed germination test of Dendrobium officinale

1．3.3 壮苗接种阶段

壮苗接种阶段主要考察不同接种密度、培养基和光质对铁皮石斛组培苗壮苗的影响，将萌发种子按照100、200和400株·瓶－13个接种密度进行试验，接种培养基见表2，培养环境为光照时间 12 h，光照强度(40 ±2)μmol·m－2·s－1，光质分别采用荧光灯和3 000 K色温LED白光，培养温度为(24±2)℃。

1．3.4 生根阶段

生根阶段主要考察LED白光在提高铁皮石斛组培苗质量方面的效果，以及对香蕉冻干粉代替香蕉应用于铁皮石斛组织培养的可行性进行研究。将经过壮苗培养的铁皮石斛组培苗接种在M22培养基中，另一部分培养基利用剥皮香蕉80 g·L－1代替冻干香蕉粉。接种密度25株·瓶－1，光照时间 12 h，光照强度(40 ± 2)μmol·m－2·s－1，光质分别为荧光灯和3 000 K 色温 LED白光，培养温度(24±2)℃。

实验材料培养3个月后，随机挑选不同光环境及培养基处理10瓶，然后随机分成3组，每组随机挑选30株组培苗，测量其株高、茎粗。

1．4 数据处理

用Excel 2007进行平均值、标准差计算及图表绘制，采用DPS 7.05进行Duncan's多重比较(P=0.05)。

表2 铁皮石斛壮苗阶段培养基配方Table 2 Medium for seedling test of Dendrobium officinale

2 结果与分析

2．1 培养基及接种密度对铁皮石斛种子萌发的影响

据统计结果，铁皮石斛1个蒴果中包含种子平均数量为30 000粒左右，单粒种子大小约为0.1 mm(图1-A)。在培养3个月后，萌发较好的原球茎呈多层次分布(图1-B)，密度较大，难以对萌发苗数量进行统计。

图1 铁皮石斛成熟种子及原球茎萌发Fig．1 Mature seed of Dendrobium officinale and seed germination

不同播种密度下，铁皮石斛在M1～M4培养基中的萌发情况如图2所示，结果表明，随着接种密度的增大，铁皮石斛种子萌发优势更明显，在4种不同培养基中均表现出一致的趋势。从不同的培养基培养效果来看，随着6-BA浓度的增加，种子萌发情况反而逐渐变差，尤其是M3和M4中，当NAA浓度一定时，种子萌发情况与培养基中6-BA浓度呈负相关。鉴于此，在随后的实验中去除6-BA，重点考察NAA及有机添加物(冻干香蕉粉)浓度与种子萌发的关系，培养结果见图3，图3中培养皿表面M1对应于表1中M5，其余依次类推。

图2 铁皮石斛种子不同培养基及培养密度的培养效果Fig．2 Effects of different medium and seed broadcasting density on Dendrobium officinale

本次试验铁皮石斛种子起始接种密度为8 000粒·皿－1，在仅添加NAA的5种培养基中培养的铁皮石斛种子的萌发较差，而在单独添加冻干香蕉粉及同时添加冻干香蕉粉和NAA的培养基中的铁皮石斛种子萌发很好，而且种子萌发率也优于基本培养基中接种密度为10 000粒·皿－1的处理。二次萌发试验结果表明，在培养基中添加冻干香蕉粉10～15 g·L－1配合NAA 0.2～0.5 mg·L－1，可有效促进铁皮石斛种子的萌发。

2．2 培养环境及接种密度对铁皮石斛壮苗培养的影响

图3 NAA和香蕉粉对铁皮石斛种子萌发的影响Fig．3 Effects of NAA and banana power on the germination of Dendrobium officinale

选择图3中M16(即表1中M20)培养基中的的萌发种苗进行不同接种培养基及接种密度测试，因培养3个月时，原球茎仍较小，计数及接种均很困难，因此，试验在假定8 000粒种子全部萌发的前提下，将1个培养皿的全部原球茎混合均匀后，按一定比例接种在培养基中，作为本次接种密度测试的培养材料，试验方案参见1.3.3节。试验过程中发现，不同培养基下铁皮石斛组培苗均能正常生长，即不同培养基对铁皮石斛壮苗培养影响差异不明显。对荧光灯与LED白光培养下的铁皮石斛进行比较，发现在LED灯下铁皮石斛种苗较细，株高增长差异不明显。

在壮苗过程中对组培苗株高影响较大的是接种密度，当接种密度为100、200株·瓶－1时，组培苗株高及茎粗增长明显;400株·瓶－1时，铁皮石斛组培苗株高较低，基部仍有大量原球茎出现，可能原因是在壮苗继代时植株表面附着大量肉眼不可见的未萌发种子继续萌发，从而造成组培苗高度差异加大(图4)。

2．3 光照环境对铁皮石斛生根的影响

图5表明，在3 000 K色温LED白光下培养的铁皮石斛组培苗株高显著高于荧光灯下的培养材料，差异达到极显著水平(图5-A)，而茎粗差异不显著(图5-B)。

图6分别为两种光照环境下铁皮石斛组培苗株高和茎粗在不同级别的数量分布比较。图6-A中，3 000 K LED白光下培养材料的株高主要集中在5.0～7.9 cm，占样品总量的84%，3个等级间组培苗的比例差别不大，均约28%，其他3个级别数量极少，占总样本数的16%;荧光灯下培养材料的株高主要集中在5.0～5.9 cm，约占总样本数55%，其余约占45%。图6-B中，3 000 K白光LED下培养材料的茎粗主要集中在3.00～4.99 mm，约占样品总量的80%，其中茎粗为3.00～3.99 mm的组培苗约占50%，4.00～4.99 mm的约占30%;荧光灯下培养材料的茎粗主要集中在3.00～4.99 mm，约占总样本数的70%，其余比例约占30%。由此可见，LED白光下培养材料的株高的一致性优于荧光灯下的培养材料。

图4 接种密度对铁皮石斛组培苗生长的影响Fig．4 Effects of culture density on the growth of Dendrobium officinale

图5 光环境对铁皮石斛组培苗生长的影响Fig．5 Effects of light on the growth of Dendrobium officinale

图6 不同光环境对铁皮石斛组培苗株高和茎粗分级情况Fig．6 Grading of Dendrobium officinale plantlets in height and stem diameter under different light condition

2．4 冻干香蕉粉在铁皮石斛生根阶段的测试

将铁皮石斛组培苗接种在添加剥皮香蕉(CK)和冻干香蕉粉(T)的培养基并分别置于荧光灯(FL)及3 000 K色温LED白光(LED)下进行培养，其株高表现如图7所示。结果表明，两种不同光环境下培养结果均表明，在添加冻干香蕉粉和剥皮香蕉培养基中培养的铁皮石斛组培苗株高无显著差异。

图7 不同添加物对铁皮石斛组培苗株高情况Fig．7 Effect of different additives in medium on the height of Dendrobium officinale plantlets

图8为两种培养基中培养铁皮石斛材料分别在3 000 K色温LED光照环境及荧光灯培养3个月后的茎粗比较，结果表明，两种不同光环境下培养结果均表明，两种有机添加物中培养的铁皮石斛组培苗茎粗无显著差异。

图8 不同添加物对铁皮石斛组培苗茎粗情况Fig．8 Effect of different additives in medium on the stem diameter of Dendrobium officinale plantlets

3 讨论

3．1 播种密度对铁皮石斛种子组培萌发的影响

已有较多研究对铁皮石斛组培技术及其影响因素进行了相关报道［4，10－11］，但关于播种密度对铁皮石斛种子萌发的影响尚未见报道。实际生产过程中，多数技术人员为了简便，一般将1个蒴果内的种子全部接种到1个培养瓶中，目前常用培养瓶内径约9 cm，按平均每个蒴果30 000粒种子计算，种子密度约高达470粒·cm－2，培养2～3个月后，培养瓶内一般会堆积2～3 cm的厚原球茎，如此一来，上层原球茎因无法获得充足养分而导致个体弱小，底层原球茎因光照较少，发育缓慢，从而导致整瓶原球茎发育程度和生理状态差别很大，笔者认为，这也是目前铁皮石斛种苗生产企业最终种苗同步化率低的重要原因。

本研究对不同播种密度的铁皮石斛种子进行了萌发试验，结果显示8 000粒·皿－1的接种密度更适合铁皮石斛种子萌发培养，此时种子密度约为125粒·cm－2，在此播种密度下，萌发原球茎呈薄层均匀分布在培养基上，厚度不超过5 mm，原球茎萌发均匀，多数已长出2片子叶，萌发培养末期，幼苗高度基本达到7～10 mm。

3．2 冻干香蕉粉在铁皮石斛组培中的应用

植物组织培养一般都会在培养基中添加一些有机物促进种苗生长，张治国等［3］利用20%的马铃薯、荸荠、香蕉提取物对铁皮石斛原球茎分化影响进行研究，表明马铃薯提取物的效果最好;蒋林等［12］研究结果认为，香蕉汁和苹果汁较马铃薯更能促进铁皮石斛试管苗根生成和生长;周江明［13］研究结果认为，萝卜提取液、水解酪蛋白、椰汁对铁皮石斛组培苗生长具有有利的影响，其次为香蕉提取液、马铃薯提取液;刘世平［14］研究认为，香蕉汁和土豆汁能够显著促进铁皮石斛丛生芽的增殖和壮苗生根;黄昌艳等［10］研究结果显示，马铃薯对种子萌发增殖较香蕉好，而在生根阶段，香蕉效果要优于马铃薯;宋顺等［15］报道，在生根壮苗培养基中添加香蕉泥有助于根的诱导和发育。由此可见，在铁皮石斛组织培养过程中有机添加物以土豆和香蕉为主，其中土豆用于原球茎分化方面效果较好，香蕉用于生根阶段效果较好，通常使用量在8% ～12%。

本研究组培快繁技术路线为铁皮石斛种子直接萌发成苗，省去了原球茎增殖、分化阶段，因此仅采用冻干香蕉粉与香蕉作为有机添加物，探究其对铁皮石斛的培养效果，结果显示，冻干香蕉粉和香蕉中培养的铁皮石斛组培苗在株高和茎粗方面差异不显著。按照8%的使用量，培养基中使用剥皮香蕉成本约为0.8元·L－1，冻干香蕉粉为50 ～60 元·kg－1，当使用量为 5 g·L－1时，使用成本约为0.3元·L－1，可降低部分组培苗生产成本。另外，在实际使用过程中，可能由于不同批次香蕉成熟度不一样，会在一定程度上影响铁皮石斛组培苗质量，而利用冻干香蕉粉，由于同批次制备量大，可在最大程度上减少因香蕉成熟度不一样导致的组培苗质量差异。

3．3 LED白光在铁皮石斛生根阶段的应用

LED应用在铁皮石斛组织培养方面也有较多报道，但多以不同红蓝比例LED混合光质研究为主，如尚文倩等［16］研究显示，红蓝光比例为1∶1时有利于铁皮石斛试管苗的生长，且组培苗株高显著优于荧光灯下培养材料;杨维杰等［17］报道，在LED红蓝混合光1∶1环境下，铁皮石斛种子萌发时间最短，相比对照可提前5～7 d;高亭亭等［18］研究表明，光质对铁皮石斛种苗和有效成分均有极显著的影响，红光有利于种苗根系与苗高生长，蓝光有利于种苗增粗与生物碱积累，红蓝混光有利于叶绿素与多糖含量增加。上述研究报道尚未构成完整的种苗生产系统，研究结果直接应用在铁皮石斛种苗生产上存在一定难度，而且在实际应用过程中发现，LED红、蓝光对人眼存在严重刺激，也在一定程度上限制了LED灯具的应用。本研究首次采用3 000 K色温LED白光，从其对铁皮石斛组培苗的生长影响来看，可代替荧光灯用于铁皮石斛组培苗照明。