71例自然流产胚胎组织染色体微阵列检测结果分析

周方元 李 艳*

自然状态(非人为目的造成)发生的流产称为自然流产。在所有临床确认的妊娠中，自然流产的发生率约为15%[1]。发生在12周以前的流产定义为早期流产，妊娠12周至不足28周的流产定义为晚期流产。其中连续自然流产2次以上称为复发性流产[2]，在育龄期妇女中发生率为4.1%[3]。自然流产的原因主要包括染色体异常、母体内分泌失调、生殖道感染、母体生殖道异常、不健康生活方式等[4]，其中孕早期流产的胚胎组织中，染色体异常的发生率为50%—60%[5]，可见流产组织的核型分析对明确流产原因有着重要作用。传统的核型分析技术需要对流产组织进行细胞培养，污染率和失败率较高，且存在分辨率低、报告周期长等缺陷[6]。随后出现的荧光原位杂交技术(Fluorescence in Situ Hybridization，FISH)虽然分辨率有所提高，但该技术不能覆盖全基因组，只能针对已知疾病进行探针选择。近十年来染色体微阵列分析技术(CMA)日趋成熟，该技术具备分辨率高、自动化程度高、不需要细胞培养、报告周期短、全基因组覆盖等优点，成为了目前检测染色体微重复与微缺失的最有力工具。因此，中国产前诊断应用专家组在2014年发布的指南中提出，对于胎死宫内或死产需行遗传学分析者，建议对胎儿组织行CMA检测，以提高其病因的检出率[7]。据此，本研究选用CMA技术针对71例自然流产组织进行染色体检测，评估CMA技术对自然流产病因分析的临床价值。

1 对象与方法

1.1 资料及分组

2017-10—2018-03在武汉大学人民医院就诊的自然流产患者71例，年龄22—45岁，平均年龄31.39±4.61岁。留取标本时，同时采集所有孕妇的外周血(应用短串联重复序列连锁分析技术排除母体细胞污染[8])。根据受检者流产时孕龄，将孕龄<12周的归为早期流产组(n=49)，孕龄12—28周的归为晚期流产组(n=22)；根据受检者此次流产之前是否具有流产史，将受检者分为有流产史组(n=49)和无流产史组(n=22)；根据受检者是否为辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)受孕，将受检者分为ART组(n=14)和非ART组(n=57)。所有行CMA检测的患者均签署知情同意书。

1.2 方法

所有流产组织及外周血采用QIAGEN公司的DNeasy Blood & Tissue Kit(50)试剂盒提取DNA(货号：69504)。CMA检测采用美国Affymetric公司的CytoScan 750K型芯片。实验严格按照Affymetric公司的配套说明书进行。提取流产物DNA后，实验严格按照 Affymetric 公司的配套说明书进行， 用NSP I限制性内切酶消化后连接通用接头，对产物进行PCR扩增，将PCR产物用磁珠纯化后进行随机片段化，将片段化产物进行标记后即可与芯片杂交读取数据分析结果。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 71例流产组织CMA检测结果

71例流产组织进行CMA检测，均获得检测结果，成功率为100.00%，其中异常结果31例，异常率为43.66%。异常结果中三体异常20例，主要包括2号、4号、8号、9号、13号、14号、16号、21号、22号及X染色体；X单体5例；四体一例，为19号染色体；整三倍体2例；结构异常2例，为XP22.33 or Yp11.32p11.31缺失，即Leri-Weill Dyschondrosteosis(LWD)综合征和17p12(14113056-15491109)x1，导致的遗传性压迫易感性神经病(HNPP)。另有非完全性葡萄胎1例。详见表1。

表1 自然流产组织CAM检测结果

2.2 不同流产孕龄组流产组织染色体异常率

早期流产组人数49例，占比69.01%。其中CMA结果正常21例，结果异常28例，异常率57.14%；晚期流产组人数22例，其中结果正常19例，结果异常3例，异常率13.64%。早期流产组异常率显著高于晚期流产组(χ2=11.68，P=0.001)。此外，早期流产组中，染色体数目异常24例，占本组异常的85.71%。

2.3 不同流产史组流产组织染色体异常率

有流产史组人数49例，其中结果正常22例，结果异常27例，异常率55.10%；无流产史组人数22例，其中结果正常16例，异常结果6例，异常率27.27%。有流产史组异常率显著高于无流产史组(χ2=4.73，P=0.03)。

2.4 不同ART受孕组流产组织染色体异常率

ART组人数14例，其中CMA结果正常8例，结果异常6例，异常率42.86%；非ART组人数57例，其中结果正常32例，结果异常25例，异常率45.45%。ART组异常率与非ART组异常率无明显差异(χ2=0.005，P=0.946)。

3 讨论

自然流产的发病机制非常复杂，其中染色体异常被认为是自然流产的主要原因。流产给孕妇的身体及精神带来极大负担，特别是多次自然流产的孕妇，其与其家属对于流产原因的诊断有迫切需求。CMA分为微阵列比较基因组杂交(Array Comparative Genomic Hybridization，array CGH)和单核苷酸多态性微阵列(Single Nucleotide Polymorphism Array，SNP Array)，能够在全基因组范围内同时检测染色体数目异常和结构异常，具有分辨率高、不需要细胞培养，可以鉴定杂合子缺失(Loss of Heterozygosity，LOH)和单亲二倍体(Uniparental Disomy，UPD)，可以检测≥30%水平嵌合体等优势[9]，为自然流产的病因诊断带来了更多的可能性。

本研究结果显示，自然流产组织的异常率为43.66%，这与楚艳等[10]的研究结果(46.6%)基本一致。其结果证实了染色体异常确实是自然流产的主要原因，另一方面也体现了CMA技术在流产原因诊断方面独特的优势。对检测结果进一步分析显示，在染色体异常的流产组织中，以三体异常为主，其中以13、16、22号染色体最多，这可能是因为18、21号染色体三体异常经由无创产前诊断技术筛查出阳性后，直接行羊水核型分析确诊后引产，并未检查流产组织所致。此外，性染色体单体也较多。可见，自然流产的染色体异常中，主要是以某一条染色体的三倍体或单倍体为主。而结构异常也有检出，本研究中检出两例结构异常：LWD综合征中文名称为Leri-Weill软骨骨生成障碍综合征，是由伪常染色体基因SHOX或SHOXY杂合缺失或SHOX下游调节区域的缺失引起的，主要表现是骨骼发育不良[10]。17p12(14113056—15491109)x1引起的HNPP，主要表现为腓神经病变以及一些非典型表现如弓形足、脊柱侧弯、耳聋等[11]。可见，CMA技术不仅可以满足流产组织中各种染色体非整倍体异常的检测，还可以检测出其它技术难以检出的染色体微重复及微缺失综合征，这为一部分过去无法通过常规技术寻找到流产原因的患者提供了新的可靠检测手段。

有研究表明，80%以上的流产发生在妊娠12周以内，即早期流产，随后流产率迅速下降，而染色体数目异常是导致胚胎早期流产的最主要原因，约占50%[12]。本研究中，早期流产占比69.01%，早期流产组的异常率57.14%，这其中主要是染色体数目异常，占本组异常的85.71%，这与此前的研究基本一致，说明CMA技术可以满足至少一半的早期流产原因的诊断。本研究中早期流产组还检出4例其它异常，分别为2例染色体结构异常，1例整三倍体，1例非完全性葡萄胎。其中，非完全性葡萄胎的检测主要是来自CMA技术检测UPD的技术优势。可见，CMA技术在早期流产的原因分析中独具优势，不仅可以检出常规的染色体数目异常，还可以弥补传统核型分析技术等无法检测的一些小片段异常及单亲二倍体等。

据统计资料表明，有习惯性流产史的孕妇体内染色体异常的几率比一般人高出几倍，最常见的异常为非整倍体，其次为多倍体[13]。本研究结果表明，有流产史组的检测结果异常率为55.10%，显著高于无流产史组异常率(27.27%)。对于有流产史的孕妇更应该警惕胎儿染色体核型异常，流产组织的核型分析具有更高的价值。同时，夫妻双方自身携带的染色体异常是导致不良孕产史的重要遗传学因素[14]，流产组织的核型异常，特别是随体染色体(13、14、15、21、22号染色体)的异常结果常常可以反过来提示夫妻双方核型异常的可能性，这可为遗传咨询及指导再次妊娠提供依据。

ART指采用医疗辅助手段使不育夫妇妊娠的技术，包括人工授精(Artificial Insemination，AI)和体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer，IVF-ET)及其衍生技术两大类[15]。针对ART是否会提高胚胎染色体异常的发生概率，多项研究对比分析了ART和自然受孕胎停育绒毛的染色体异常发生率，发现两组的异常率差异无统计学意义[15,16]，这与本研究结果一致，即ART技术并未增加胚胎染色体异常的发生率，但这并不意味着ART技术对胚胎染色体异常无影响。在此基础上，有研究进一步探讨了ART受孕和自然受孕的自然流产中异常类型的差异，发现经ART早孕期自然流产与自然妊娠相比，虽然有相似的胚胎染色体异常率，但有不同的异常类型，染色体数量异常是ART受精后自然流产胚胎的主要异常核型[17]，但也有研究表明，ART妊娠后的高流产率与流产胚胎的染色体异常密切相关,但是其染色体异常的发生率和异常类型与自然妊娠后流产时无明显差异[18]。可见，目前大多研究都支持ART技术对于胚胎染色体异常的发生率无明显影响，但其对于染色体异常类型是否具有影响尚无定论，有待进一步研究。

综上所述，染色体异常是自然流产的主要原因，其异常率与孕妇流产时孕周、是否有流产史等因素有关，与是否为ART受孕无关。临床在针对早期流产、习惯性流产孕妇进行流产原因的分析及遗传咨询时，应首先考虑到胚胎染色体异常。利用CMA技术分析流产原因具有成功率高、分辨率高、耗时短等优点，能够更全面地分析各类染色体异常，但其不能检测平衡易位、倒位缺点，在一定程度上限制了其应用。因此应该将CAM与其它核型分析技术相结合，提高流产原因的诊出率。