血清miRNA-21、Smad1联合尿NGAL检测对早期糖尿病肾病的诊断价值

王钱虎，陈锂，彭亮

（杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006）

早期糖尿病肾病症状不明显，进展缓慢，缺乏明确的诊断指标，发现并采取积极的治疗有助于延缓甚至阻止病程进展，对逆转或延缓肾功能损害具有重要意义[1-2]。血清miRNA-21参与血管内皮细胞功能变化，miRNA-21表达下调与糖尿病肾病的发生及进展密切相关[3]。人信号转导分子1（Smad1）为肾脏功能紊乱的标志物之一，其水平与肾小球系膜基质积聚程度呈正相关，可用于评价糖尿病肾病的严重程度[4]。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）是肾脏保护性蛋白，参与多种肾脏疾病的发生发展，是反映急性肾损伤的有效指标，能够反映肾小管功能[5]。本研究旨在探讨血清miRNA-21、Smad1联合尿NGAL检测对早期糖尿病肾病的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年3月-2016年12月本院收治的130例糖尿病患者（糖尿病组），所有患者均符合2010年糖尿病的诊断标准[6]，餐后血糖＞11.1mmol/L，空腹血糖＞7.0mmol/L，糖化血红蛋白＞9.0%。选择同期210例早期糖尿病肾病患者（早期糖尿病肾病组），所有患者均符合糖尿病早期肾病的诊断标准[7]，尿白蛋白排泄率20～200μg/min。排除标准：（1）有内分泌、心血管、泌尿系统免疫性疾病患者；（2）原发性肾病、肾动脉狭窄，以及心脏、肝脏及其他全身疾病所致的肾脏疾病患者。两组一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，详见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法 所有患者均于早晨空腹抽取肘静脉血3mL置于干燥试管中，室温3000r/min离心10分钟，取上清液，-80℃冻存备用。采用聚合酶链反应（PCR）检测血清 miRNA-21，Trizol提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取血清总RNA，按照mRNA逆转录试剂盒 （上海生工生物工程有限公司）说明书进行逆转录反应，95℃变性，60℃退火，40个循环。计3个复孔，以重水为阴性对照。根据标准曲线及待测样本二阶导数最大分析法计算的Ct值计算miRNA-21水平。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）定量测定血清Smad1水平，严格按照试剂盒（南京建成生物科技有限公司）说明书操作。留取清晨中段尿5mL，室温3000r/min离心10分钟，取上清，-80℃冻存备用。采用ELISA法检测尿NGAL水平，严格按照试剂盒（福建迈新生物技术有限公司）说明书操作。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料以百分率表示，并采用χ2检验；计量资料以（±s）表示，采用独立样本或配对资料t检验，采用Pearson进行相关分析，用ROC曲线分析筛选敏感度和特异度。

2 结果

2.1 血清miRNA-21、Smad1和尿NGAL水平 早期糖尿病肾病组血清miRNA-21含量显著低于糖尿病组，血清Smad1和尿NGAL水平显著高于糖尿病组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。详见表2。

2.2 ROC曲线分析 以灵敏度为纵坐标，1-特异度为横坐标，绘制早期糖尿病肾病患者ROC曲线。血清miRNA-21、Smad1、尿NGAL的灵敏度、特异性、阳性似然比、尤登指数显著低于三者联合检测，差异有统计学意义（P＜0.05）。 血清 miRNA-21、Smad1、尿NGAL的阴性似然比显著高于三者联合，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图1和表3。

表2 两组血清 miRNA-21、Smad1和尿 NGAL比较（±s）

表2 两组血清 miRNA-21、Smad1和尿 NGAL比较（±s）

与糖尿病组比较**P＜0.01

尿N G A L（μ g/L）糖尿病组 1 3 0 9 7.2 4±8.3 7 0.6 9±0.1 7 1 6.5 2±5.2 6组别 n m i R N A-2 1（%）S m a d 1（n g/m L）早期糖尿病肾病组 2 1 0 7 2.1 5±6.4 2** 1.0 4±0.2 1** 5 9.4 7±9.6 8**

2.3 血清miRNA-21、Smad1和尿NGAL相关性分析 早期糖尿病肾病患者血清miRNA-21和Smad1、尿 NGAL 呈负相关（r=-0.683，r=-0.714，均P＜0.05）；血清Smad1和尿 NGAL呈正相关（r=0.806，P＜0.05）。

表3 血清miRNA-21、Smad1、尿NGAL和三项联合的诊断效能

3 讨论

糖尿病是临床上常见的内分泌代谢性疾病，机体高血糖的状态下内皮细胞释放大量内皮血管活性物质，造成肾小球及毛细血管硬化，加快非酶促糖基化，导致糖尿病肾病[8]。糖尿病肾病为糖尿病严重微血管并发症，是导致死亡的主要原因。早期糖尿病肾病症状隐匿，难以确诊。目前早期糖尿病肾病诊断主要依靠微量尿蛋白，但易受多种因素影响，对肾损伤程度缺乏差异性，肾活检为诊断早期肾病的金标准，但其具有创性[9]。寻找早期糖尿病肾病敏感、特异、无创性指标对于确诊和指导早期干预具有重要意义。

miRNA在糖尿病发生发展中具有重要作用，miRNA-21为可抑制靶基因转录，其表达不受重蛋白编码启动子调控，其血清含量在糖尿病肾病患者中的表达与病情严重程度有关[10]。Smad1可上调Ⅳ型胶原表达，活化肾小球硬化分子，其表达与白蛋白尿水平无关，与早期系膜基质的积聚密切相关，是糖尿病肾病早期诊断的新型生物指标[11]。NGAL为脂质运载蛋白，参与免疫应答、脂质代谢、细胞分化凋亡等过程，可通过介导铁离子转运，促进原始肾小管上皮细胞发育，当肾组织受到损害后促进肾小管的形态及功能的恢复，参与多种肾脏疾病发生发展过程[12-13]。血清miRNA-21、Smad1和尿NGAL虽均与糖尿病肾病有关，但其在早期糖尿病肾病的含量和表达尚缺乏研究。

本研究发现，早期糖尿病肾病组血清miRNA-21含量显著低于糖尿病组，而血清Smad1和尿NGAL水平显著高于糖尿病组，且血清miRNA-21和Smad1、尿NGAL呈负相关，血清Smad1和尿NGAL 呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。ROC曲线显示血清miRNA-21、Smad1联合尿NGAL检测优于单个指标，差异有统计学意义（P＜0.05）。早期糖尿病肾病患者肾小管上皮细胞NGAL高表达，且NGAL先于尿微量白蛋白反映肾功能损伤，早期肾小管损害即可引起血清Smad1的高表达，患者全身氧化应激状态导致病情的进展，损伤肾小球和内皮细胞功能，加重病情，导致血清miRNA-21含量降低，表达下调。

血清miRNA-21、Smad1联合尿NGAL检测早期糖尿病肾病具有较高的诊断效能，有望成为早期糖尿病肾病的诊断指标。但本研究没有与微量尿蛋白这一指标进行比较，需进一步进行探讨。