猪圆环病毒2型Taqman探针法实时荧光定量PCR检测方法的建立

石 林，吴 瑗，巴少波，刘正奎，陈 琳，王 磊，邵春艳，孙 静，周莹姗，王晓杜，宋厚辉

（1.浙江农林大学 动物科技学院，浙江 杭州311300；2.金华职业技术学院 农业与生物工程学院，浙江金华 321007）

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）是引起猪Sus scrofa圆环病毒相关综合征（PCVAD）的主要病原体之一，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、母猪繁殖障碍、猪呼吸道疾病综合症（PRDC）、猪皮炎与猪肾病综合症（PDNS）、肠炎和先天性震颤等疾病［1－2］。PCV2对外界和一般消毒剂的抵抗力较强，在酸性环境及氯仿中可以存活较长时间甚至在高温环境（72℃）也能存活一段时间。PCV2易通过胎盘垂直传播，感染猪群的免疫功能下降后发病，常与猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）或猪细小病毒（PPV）混合感染，也易继发猪副嗜血杆菌或猪链球菌2型感染［3］。PCV2主要感染哺乳期和育成期的仔猪，尤其5～12周龄仔猪特别易感，常并发或继发细菌感染而导致死亡率大大增加［4］。PCV2最早发现于加拿大，后蔓延至美国、西班牙、英国、丹麦、德国、荷兰、比利时、日本和韩国等，发病率为10%～80%，死亡率为15%～30%［5］。PCV2在中国猪群中早已存在，2002年后发病猪群逐渐增多，死亡率为20%～30%［6－7］。临床上防控该病主要采用疫苗接种方法，虽然控制了大规模流行的趋势，但是一些饲养管理不当的养殖场仍然存在较高的发病率。为及时诊断该疾病，及早接种疫苗和加强生物安全措施，亟需建立起一种高灵敏性、快速高效的检测方法，以减少疾病所导致的损失。实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）技术是一种简单、快速、灵敏度高的检测技术，应用到动物疫病诊断上，主要采用基于SYBR Green I和Taqman探针的2种荧光定量检测方法，相比而言，Taqman探针灵敏性更高。因此，本研究拟利用针对PCV2的ORF1基因特异引物和TaqMan探针，建立一种实时荧光定量PCR检测技术，为PCV2的实验室诊断和疫病预警预报提供检测工具。

1 材料和方法

1.1 病毒

猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）均由浙江农林大学动物预防医学与公共卫生实验室保存，猪流行性腹泻病毒（PEDV）-猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）-轮状病毒（RV）三联疫苗购自哈尔滨维科生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物与探针的设计 从GenBank中下载PCV2特异性的ORF1基因（Genbank：MF616438.1）序列，利用Beacon Designer 7软件找出该基因上的高保守序列，设计1对特异引物和1条带有FAM（6-羧基荧光素）标记和碎灭为MGB（Minor Groove Binder，小沟结合物）的Taqman探针。上游引物（ORF1-F）序列：5′-TAGATCTCAAGGACAACGGAGTGA-3′； 下游引物（ORF1-R）序列：5′-GTTACAGGGTGCTGCTCTGCA-3′；探针序列：5′-FAM-CAGACTCCCGCTCTC-MGB-NFQ-3′。所有序列均由上海金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 阳性质粒标准品的构建 应用特异引物（ORF1-F/R），以PCV2的DNA为模板进行PCR扩增。反应条件为94℃ 5 min；98℃ 10 s，60℃30 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃ 10 min，15℃ 5 min。利用DNA凝胶回收试剂盒（上海生工生物有限公司）纯化回收PCR产物，连接至pMD18-T（大连宝生物工程有限公司）克隆载体后，转化大肠埃希菌Escherichia coli（DH5α）感受态细胞。经蓝白斑筛选得到阳性克隆，用菌落PCR和质粒PCR鉴定获得阳性重组质粒（命名为pSL1353），送生物公司（上海金唯智生物科技有限公司）测序验证。所获质粒经核酸蛋白浓度测定仪测定浓度和纯度，置于－20℃备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR反应条件的优化 配制实时荧光定量PCR的反应体系，其中上、下游引物各0.4 μL， SYBRPremix EXTaq10.0 μL， 模板（pSL1353） 2.0 μL， 超纯水补足至 20.0 μL。 对反应条件进行优化，分别设置退火温度为54，56，58，60和62℃，以获得该方法的最佳退火温度。分别采用0.2，0.3，0.4和0.5 μmol·L－1的引物浓度，构建PCR反应体系，确定该方法的最佳引物浓度。采用0.1， 0.2， 0.3， 0.4 和 0.5 μmol·L－1的探针浓度， 上、 下游引物各 0.4 μL， rTaq酶和 dNTP 混合物 10.0μL，模板（pSL1353，超纯水为空白对照）2.0 μL，超纯水补足至20.0 μL，确定最佳Taqman探针浓度。

1.2.4 实时荧光定量PCR反应标准曲线建立及线性范围 将1.2.2得到的pSL1353质粒以10倍梯度稀释成 1013， 1012， 1011， 1010， 109， 108， 107和 106拷贝·L－1； 以 1.2.3 得到的优化条件进行荧光定量 PCR扩增，重复3次·浓度－1；以阳性重组质粒拷贝数为横坐标，以各浓度下的循环数（Ct）值为纵坐标，建立Taqman探针实时荧光定量PCR 标准曲线。 其中拷贝数计算公式： 拷贝数（拷贝·L－1）＝质粒浓度（g·L－1）×阿弗加德罗常数/重组质粒分子量［8］。

1.2.5 实时荧光定量 PCR敏感性试验 将 pSL1353质粒稀释成 1 000×106，100×106，50×106，20×106， 5×106和 106拷贝·L－1， 设置 6 重复·浓度－1， 测定各浓度下的循环数（Ct）， 用 PODLOD calculation program（version 8）［9］计算本检测方法的最低检测限值。

1.2.6 实时荧光定量PCR重复性试验 以空白模板对照，检测已知的PCV2 DNA样品，间隔1周做重复试验， 重复 3 次·样品－1（组间）； 检测已知的 3 个 PCV2 DNA 样品（1013， 1012， 1011拷贝·L－1）， 重复 6个·样品－1（组内）。 计算组内和组间变异系数（CV），验证该方法的重复性。其中SCt为Ct的标准差，为Ct的平均值。

1.2.7 实时荧光定量PCR特异性试验 以1.2.3建立的PCV2 Taqman探针实时荧光定量方法同时对CSFV，PRRSV，PEDV/TGEV/RV进行检测，以空白模板为对照，确定该方法的特异性。

1.2.8 临床样品的检测 以1.2.3建立的PCV2 Taqman探针实时荧光定量方法检测2016－2017年杭州市周边地区规模化生猪养殖场送检的50份疑似病料（腹股沟淋巴结）。

2 结果与分析

2.1 PCV2阳性标准品的制备

以PCV2疫苗毒株所提取的DNA为模板，利用特异性引物（ORF1-F/R）扩增出大小约100 bp的片段；扩增产物回收后借助T/A克隆技术，构建pMD18-T-PCV2-ORF1载体（pSL1353），经菌落PCR和质粒PCR鉴定为阳性克隆（图1）。测序验证其序列，发现与NCBI上PCV2的序列（GenBank：KY940521.1）同源性达 100%。提取pSL1353质粒作为本研究方法的阳性质控，可以作为判断试验成立与否的阳性模板。

2.2 实时荧光定量PCR反应体系及反应程序的优化

依据1.2.3，发现退火温度为60℃时扩增效率最高。在PCV2质粒浓度1013拷贝·L－1时进行反应条件优化，根据有典型扩增曲线且Ct值最小的原则， 发现上、 下游引物浓度 0.2 μmol·L－1（图 2A）和探针浓度 0.2 μmol·L－1（图 2B）时扩增效果最佳。 该结果可作为试剂盒开发及成本控制的理论依据。

图1 阳性标准质粒的PCR鉴定Figure 1 Identification of positive standard plasmids by PCR

2.3 实时荧光定量PCR标准曲线的建立

将稀释（1013， 1012， 1011， 1010， 109， 108， 107， 106拷贝·L－1）后的重组质粒作为模板， 在 2.2 的 Taqman探针实时荧光定量PCR优化条件下进行扩增（图3A），得到标准曲线如图3B所示，其线性回归方程为Ct＝－0.671 4×lgA＋38.16，其中A为模板浓度。相关系数（R2）为0.974 5，表明本研究所建立的方法在模板为2.1×1013～2.1×106拷贝·L－1时，检测到Ct值和模板之间具有较好的线性关系。

2.4 实时荧光定量PCR的重复性

选取2.3中1013，1012，1011拷贝·L－1阳性质粒为模板，在2.2优化条件下进行重复试验。结果表明：组内样品扩增曲线重复性较好（图4），组内与组间Ct值的变异系数较小（表1）,表明该检测方法有较好的重复性。

图2 反应体系和反应条件的优化Figure 2 Optimized system and conditions of reaction of PCV2

图3 实时荧光定量PCR标准曲线的建立Figure 3 Standard curve of the real-time quantitative PCR of PCV2

2.5 实时荧光定量PCR的灵敏性

阳性标准质粒 pSL353分别按照 1 000×106，100×106， 50×106， 20×106， 5×106和 106拷贝·L－1， 重复 6 次·浓度－1，进行实时荧光定量 PCR扩增，有典型的扩增曲线且Ct值小于38时判断为阳性。结果表明：每个浓度均具有较好的重复（图5）。PODLOD V8软件［9］公式计算，得到该方法的最低检测线为 8.828×106拷贝·L－1（95%的检测限）（表 2）。

图4 PCV2实时荧光定量PCR重复性试验扩增曲线Figure 4 Amplification curve of repetitive assay PCV2

2.6 实时荧光定量PCR的特异性

分别以 PCV2的基因组 DNA，PEDV，TGEV，PEDV/TGEV/RV三联疫苗的cDNA为模板，利用1.2.3构建的检测方法进行实时荧光定量PCR扩增。结果表明：PCV2病毒组有特征性扩增曲线，其他各组则没有，说明该方法具有较好的特异性（图6），为临床疾病混合感染情况下准确检测PCV2提供了工具。

表1 实时荧光定量PCR的重复性验证Table 1 Repetitive assay of the real-time quantitative PCR

2.7 临床样品的检测

以实验室收集到的2016－2017年杭州市周边地区规模化生猪养殖场的50份PCV2疑似病料（腹股沟淋巴结）为检测样本，提取样本中的DNA，利用本研究的PCV2实时荧光定量PCR检测方法进行检测。结果表明：送检50份样品中该方法检出40份阳性，待检样品的PCV2阳性率达80%（表3），与普通PCR检测结果基本一致。

图5 PCV2的实时荧光定量PCR灵敏性扩增曲线Figure 5 Amplification curve of sensitivity assay of PCV2

图6 实时荧光定量PCR方法特异性扩增曲线Figure 6 Amplification curve of specificity analysis

3 讨论

PCV2是目前规模化猪场疾病防控中最重要的病原体之一，通常伴随细菌感染［10］，因此要检定出PCV2，需要建立高度灵敏的检测方法。YANG等［11］建立的基于SYBR Green I检测 PCV2 的方法检测范围是 109～1017拷贝·L－1， 郑兰兰等［12］建立的PCV2和PRV二重SYBR Green I荧光定量PCR方法对PCV2的检测灵敏度是215×106拷贝·L－1；本研究建立的方法能检测PCV2病毒基因组DNA最低浓度达到为8.825×106拷贝·L－1，比常规PCR和基于SYBR Green I的荧光定量PCR更加灵敏。影响实时荧光定量PCR方法的灵敏度涉及许多因素，如样品来源的复杂程度，引物和探针特异性，体系及扩增条件等，其中引物和探针的设计是最重要的关键点。SYBR Green I法是基于荧光染料与双链DNA结合后检测荧光值来判断产物的量，而Taqman探针法则是基于DNA酶的5′外切酶活性对探针的切割后，荧光信号的强弱判断扩增产物的量，因而探针的特异结合使得该方法具有更高的特异性。本研究针对PCV2的ORF1保守区域设计特异引物，有利于扩增PCV2所有基因型的毒株，其探针则是基于15碱基的特异序列，具有较高结合效率；普通Taqman探针一般为25～35 bp， 而MGB探针由于在普通Taqman 3′端特殊的设计，长度更短，一般为10到15 bp，因而灵敏性更高，同时还具有淬灭无荧光、背景低等特点。所以本研究采用的淬灭基团为MGB的Taqman探针，提高了检测灵敏度，降低了背景值。

表2 实时荧光定量PCR的灵敏度Table 2 Sensitivity of the real-time quantitative PCR

表3 实时荧光定量PCR方法检测临床样品PCV2的结果Table 3 Results of detecting PCV2 from clinical samples by fluorescent quantitative PCR

基于ORF2（Cap）基因分类方法，分子流行病学分析认为PCV2在临床上流行主要为 PCV2a，PCV2b 2个基因型［13］，且后者的流行明显超过前者；近期发现还存在PCV2c，2d，2e等基因型［14－15］。本研究在设计引物时针对相对保守的ORF1（Rep）基因，因此能够检测PCV2的所有基因型，为临床诊断提供了可靠的检测工具。