电针对脑卒中后抑郁大鼠脑细胞生长因子EGF、BFGE表达的影响

2018-11-29 03:13陆方琴严嘉宁赵立峰韦登明
中国老年学杂志 2018年22期
关键词:电针海马神经元

余 涛 陆方琴 严嘉宁 赵立峰 韦登明

(宁波大学医学院病理学教研室,浙江 宁波 315211)

脑卒中后抑郁(PSD)指脑卒中导致的有明显临床症状的一种继发性抑郁症,是脑卒中发生后以情绪低落、兴趣减退为主要表现的一种心理障碍。电针治疗是一种安全无毒疗效显著的治疗手段,前期研究已经确定其对PSD有治疗效果〔1〕。但其治疗机制尚不完全清楚。有研究证实,普通慢性抑郁症患者或动物均出现海马体积减少的现象,海马体积的减少与海马神经发生障碍有关。表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)被证实能促进胚胎或成年神经干细胞的分裂增殖〔2〕。但PSD的发病及电针治疗机制是否与海马BFGF和EGF表达变化有关,尚有待研究。本实验拟分析电针对PSD大鼠海马神经细胞发生的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 Wistar大鼠40只,购于浙江大学医学院实验动物中心,动物合格证号0102016。均为雄性,体重280~320 g,自由饮食。大鼠适应性喂养7 d后,随机分为正常组、假手术组、模型组和电针治疗组,每组10只,采用Open-field法进行行为学检测。

1.2试剂仪器 G6805电针仪(上海华谊仪器制造厂生产),旷场及记录仪(上海移数动物学系统),兔抗大鼠EGF、BFGF多克隆抗体,生物素化羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),JD801形态学图像分析系统(江苏捷达有限公司),BM-Ⅶ包埋机(宏业医用仪器公司),HM-325石蜡切片机(德国LEICA公司),CX40生物显微镜(日本olympus公司)。

1.3模型制备 脑卒中模型制备和PSD模型制备。脑卒中模型制备参照王蕊等〔3〕推荐的方法对模型组、电针治疗组进行造模,将大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg体重)麻醉后,仰卧位固定在手术台上,常规消毒,颈正中切口,暴露双侧颈总动脉(CCA)并分离出迷走神经。随即用无创动脉夹夹闭CCA,夹闭10 min再通20 min,再夹闭10 min。青霉素粉剂局部消毒再缝合伤口,放回笼中保温饲养。假手术组麻醉及手术过程同上,但不夹闭CCA。正常组不做任何处理。模型成功的标志是大鼠即刻出现Horner征。PSD模型制备参照洪灯等〔4〕的方法,对脑卒中模型成功的大鼠予以慢性温和应激(CUMS)制备PSD模型。具体操作:①夹尾1 min;②禁水17 h;③4℃强迫游泳5 min;④持续光照17 h;⑤水平摇晃5 min;⑥倾斜鼠笼(45°)17 h;⑦湿笼(100 g锯屑+200 ml水)21 h;⑧行为限制(束缚)2 h;⑨禁食禁水20 h。9种刺激每日随机采取1种,但同种刺激不连续出现,连续不间断刺激21 d。

1.4电针治疗方法 进行不同时间周期连续治疗。电针治疗组大鼠术后1 w手术切口已基本愈合。PSD模型制备成功后伤口已痊愈,开始给予电针治疗。针刺穴位参考《实验针灸学》〔5〕:用28号30 mm长毫针,于百会穴(顶骨正中)斜刺1.67 cm,大椎穴(第7颈椎与第1胸椎间背部正中)正刺1.67 cm。连接G6805电针仪,施以连续波,频率50 Hz,强度以大鼠安静耐受为度(约2.0 rflA),每天电针1次,留针20 min,连续治疗15 d。

1.5行为学检测 参照林晓春等〔6,7〕的旷场试验法:将大鼠单个放入开野箱的中央格,开始记录其活动。以双后肢穿越一方格边界记为一次水平运动,以两前肢离地且直立记为一次垂直运动,二者反映动物的探究活动,检测6 min(其中第1分钟不计,使大鼠适应环境,共计5 min数据),实验期间保持环境安静与黑暗。及时清除每只动物的排泄物,并喷洒酒精去除箱底、边异味,各组交替测试。每只动物进行1次(1次/6 min)。测定5 min内箱内大鼠水平运动次数和垂直运动次数。旷场试验的水平活动反映大鼠运动活动性水平;垂直活动的多少则反映其兴趣高低。分别在造模前、造模后和治疗后测定大鼠行为变化。

1.6脑组织生长因子免疫组织化学染色方法 实验结束后,灌注固定后取脑,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g体重),暴露心脏,先用静脉套管针经主动脉用100 ml生理盐水进行冲洗,再灌注由4%多聚甲醛与1%戊二醛组成的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)200 ml,灌注约40 min,灌注完毕后断头取大脑组织。将取出的脑组织浸没于装有甲醛固定液管中,并置于-80℃冰箱保存24 h。

石蜡包埋切片制作并进行免疫组织化学染色:切片经常规脱腊、脱水、3%过氧化氢(H2O2)在37℃下处理15 min;微波抗原修复后滴加10%正常羊血清在37℃下处理 10 min,勿洗;滴加1∶100稀释的一抗(抗BFGF、EGF),在4℃下处理24 h;滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶100)在37℃下处理2 h;滴加SABC适量,在37℃下处理1 h;二氨基联苯胺(DAB)显色5~10 min;阴性对照实验用PBS代替一抗,其余步骤相同。每步之间用0.1 mol/L PBS(pH值7.4)洗3次,每次5 min。常规脱水、透明、封片,光学显微镜下观察免疫组化染色结果。结果判断:显微镜下海马神经细胞胞质呈棕色为阳性细胞,每张切片在400倍显微镜下选取4个视野用 RY-2000瑞医病理图文分析系统计算其积分光密度〔8〕。

1.7统计学检测 采用SPSS13.10统计软件进行单因素方差分析,组间两两比较用LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组BFGF、EGF积分光密度比较 正常组、假手术组脑组织见较多EGF和BFGF免疫阳性细胞;模型组很少,较正常组显著下降(P<0.05)。电针治疗组较模型组EGF和BFGF积分光密度值明显增高(P<0.05),见图1,表1。

图1 各组脑组织EGF、BFGF免疫阳性细胞比较(×400)

表1 各组BFGF、EGF积分光密度比较

与模型组比较:1)P<0.05;同表2

2.2各组水平、垂直运动次数比较 正常组与假手术组水平、垂直运动次数差异无统计学意义(P>0.05),模型组较正常组和假手术组明显减少(P<0.05),电针治疗组较模型组明显增多(P<0.05),见表2。

表2 各组水平、垂直运动次数比较次)

3 讨 论

PSD相当于中医学中“郁证”的范畴,属于因病致郁〔9,10〕,其病因机制复杂,发病机制尚不清楚。有文献〔11〕报道,脑卒中后第1年的PSD发病率为20%~50%。PSD 不仅影响患者神经及肢体功能的康复,降低生活质量及生活满意度,同时也增加了脑卒中病死率,给患者亲属带来精神和经济上的极大负担。

目前西药在PSD的治疗中明显存在副作用严重、起效慢、价格昂贵等问题。中药方面,肖潇〔12〕以逍遥散加味为基本方治疗,在改善患者中医症状、对患者神经功能缺损的改善及提高患者日常生活能力方面效果颇好,且起效快,副作用少;陈德仁〔13〕用丹栀逍遥散加减治疗PSD,患者症状显著改善,生活自理能力有所提高。Kim等〔14〕发现电针可改善抑郁状态,王忠华〔15〕电针治疗PSD,发现治疗效果优于口服百忧解。针刺作为一种传统的治疗手段正逐渐被接受,其在改善患者临床症状及生活质量方面疗效确切,已成为药物治疗抑郁症的有效补充〔16〕。百会和大椎是2个益智要穴,位于督脉之上。百会位居巅顶,为手足三阳经与督脉及阴肝经之会,为督脉要穴,百脉聚会之处,故可调补中气,健脑宁神;大椎为“三阳督脉之会”〔17〕。针刺两穴,可醒脑益智开窍、振奋阳气,并达阳以生阴之功〔11〕。以往研究表明,电针百会、大椎穴有提高脑卒中大鼠海马神经突触素(Syp)表达和增加海马神经元数量的作用,从而增强海马突触可塑性,而海马神经突触可塑性提高与促进海马神经细胞发生有关〔18〕。故本实验选穴以督脉之百会、大椎为治疗穴。

脑卒中发病时,脑组织的缺血缺氧使神经元能量代谢发生障碍,引起谷氨酸大量释放,导致谷氨酸受体过度活化,产生兴奋性毒性,导致神经元变性、死亡〔19〕。BFGF主要定位于海马CA2神经元〔20〕,可以作为反映创伤愈合的细胞因子;EGF主要定位于嗅球、下丘脑及小脑神经元组织中〔21〕。有研究表明BFGF可以促进有丝分裂,促进微血管的生长及分化,增加局部毛细血管数,促血管生成,在神经损伤中保护神经元细胞,促进神经胶质细胞分裂增殖〔22〕。BFGF不仅能缩小大鼠脑梗死面积,还可以使缺血损伤后的脑血流量显著增加。在脑缺血损伤的治疗中,能使神经再生,从而促进脑缺血后的神经功能恢复〔23〕。EGF对于哺乳动物细胞是强力的有丝分裂因子,可促进中枢神经系统神经元祖细胞、神经元及神经胶质细胞增殖和分化。其还是一个重要的神经营养因子,可通过刺激甲状腺激素和多功能蛋白聚糖G3片段来促进神经突生长〔24〕。EGF具有与BFGF类似的作用,二者不仅具有有丝分裂原的作用,还可促进细胞分化并决定细胞分化方向,实验证明BFGF和EGF联合使用,可诱导骨髓基质细胞化(BMSCs)分化为神经样细胞〔25〕。而对神经干细胞分化方向上的影响存在明显差异,BFGF作用下分化的细胞主要表达神经元细胞特异性标志分子,EGF作用后则主要分化为神经胶质细胞〔26〕。本研究行为学结果提示,电针对PSD大鼠的抑郁治疗有效。本研究免疫组织化学染色结果表明,电针对PSD大鼠神经元的修复与再生有促进作用。因抑郁症患者海马体积缩小,结合本实验结果认为,针刺改善PSD大鼠神经元的修复与再生的机制可能由于提高了海马神经生长因子BFGF和EGF的含量,从而对海马神经元的可塑性进行调节,促进海马神经细胞发生和神经功能的恢复,这可能是针刺抗抑郁的分子机制之一,电针对调节PSD大鼠海马神经再生的具体机制有待于进一步研究加以明确。

猜你喜欢
电针海马神经元
海马
电针基于不同参数治疗坐骨神经损伤的实验研究进展
俯卧位手法整复结合电针治疗胸椎小关节紊乱
海马
跃动的神经元——波兰Brain Embassy联合办公
电针与干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展
ERK1/2介导姜黄素抑制STS诱导神经元毒性损伤的作用
电针改善脑卒中患者膝过伸的效果
毫米波导引头预定回路改进单神经元控制
侧脑室注射DIDS对缺血再灌注脑损伤大鼠神经元凋亡的拮抗作用