白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素和大黄素对2BS细胞生长增殖能力的影响

王培昌 张雁冰

(首都医科大学宣武医院检验科，北京 100053)

复制性衰老又称细胞衰老，是指体外培养的细胞只能进行有限次数的分裂〔1〕。复制性衰老是生物整体衰老的基础，鉴于在生物整体水平上衰老研究标准化瓶颈，复制性衰老研究可作为衰老研究的主要手段。衰老的自由基(FR)学说认为，FR水平随龄累积，通过脂质过氧化及对生物大分子的损伤而致细胞衰老〔2〕。前期研究发现，抗氧化剂L-肌肽、氨基胍可有效灭活FR，并可延缓细胞衰老〔3,4〕。白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素、大黄素富含于葡萄、大豆、生姜、大蒜等水果或食物中，且具有较强的抗氧化活性〔5～8〕，其对细胞衰老如何影响？本文以人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)为模型，观察上述抗氧化剂对细胞体外传代次数(PDs)、细胞生长增殖能力、细胞表型及DNA损伤修复能力的影响。

1 材料与方法

1.1抗氧化剂 白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素和大黄素皆为分析纯(西安天行健天然生物制品有限公司，西安)，由二甲基亚砜(DMSO)溶解，储存液浓度为1 mmol/L，再由DMEM培养液稀释至所需浓度，同体积的DMSO加入DMEM作为对照。

1.2细胞 2BS(北京天坛生物制品股份有限公司，北京)细胞形态及细胞学特征均无异常，体外培养代龄平均为55～60代，30代以下为年轻细胞，55代及以上为衰老细胞。

1.3主要仪器 酶标仪(Bio-TEK，Rockville，MA，USA)，普通光学显微镜(Olympus)，ImageMaster VDS成像系统(Pharmacia Biosci Inc，Sweden)。

1.4细胞培养〔4〕使用含有10%胎牛血清(Logan，UT，USA)的DMEM培养基(Gibco，BRL)，在饱和湿度、37℃、5%CO2通用培养条件下培养。当细胞融合度85%～90%时，按1∶2或1∶4传代。普通DMEM培养基培养20 h，待细胞全部贴壁后，转入含药培养基继续培养，对照组2BS培养基加入同体积DMSO。

1.5药物对细胞毒性的观察 融合状态的2BS细胞(28代)，传代并接种于无菌6孔板或24孔板，普通DMEM培养20 h，转入含不同浓度药物的DMEM继续培养3 d，普通光学显微镜下观察细胞生长状态、细胞排列及融合状况、胞体是否收缩或裂解、细胞碎片及中毒颗粒的多少等，各抗氧化剂浓度梯度设为1、10、50、100、200、500、1 000 μmol/L。

1.6抗氧化剂对细胞增殖能力的影响〔4〕将2BS细胞接种于96孔细胞培养板，每孔细胞数2.5×103个，每孔体积200 μl。普通DMEM培养基于37℃、5%CO2条件下培养20 h，换含药DMEM培养基并于上述条件下继续培养72 h，每孔加25 μl四甲基偶氮唑盐(MTT，10 mg/ml)，37℃、5%CO2条件下培养4 h，小心吸净孔内液体，每孔加0.2 ml DMSO，使结晶物充分溶解，以DMSO作空白，于10 min内测定每孔在490 nm处的吸光值。每点设6个平行样孔。

1.7抗氧化剂对2BS细胞DNA损伤的影响 将30代龄2BS细胞，以不同浓度的含药DMEM培养基培养4 h(药物浓度梯度为10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L)，收集细胞，以下述程序行彗星试验〔4〕：取110 μl 0.5%的正常熔点琼脂糖(NMA)铺于预冷的磨毛玻片上，用盖玻片压平胶面，4℃凝固15 min，移去盖玻片，于37℃水浴中将100 μl 1%低熔点琼脂糖(LMA)与等体积的细胞悬液混匀，细胞密度约为1×106个/ml，取75 μl铺于第一层胶上，迅速盖上盖玻片，4℃凝固15 min，去掉盖玻片。将胶板浸于预冷的细胞裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，10 mmol/L Tris，pH 10，1%Triton X-100)中，4℃避光裂解1 h，取出胶板，放于水平电泳槽中，加入新配制的电泳缓冲液(0.3 mmol/L NaOH，1 mmol/L Na2EDTA，pH 13)，4℃、避光静置10 min，4℃、15 V(1 V/cm，200 mA)电泳25 min。将胶板移置一洁净平皿中，中和液(0.4 mol/L Tris-Cl，pH7.5)中和两次，然后以5 μg/ml的PI避光染色20 min，置于荧光显微镜(TCS.SPZ，Leica，Manheim，Germany)下观察，摄取图象。绿光激发，激发波长567 nm，阻挡波长590 nm。

1.8统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1四种抗氧化剂对2BS细胞体外PDs的影响 各含药培养基(抗氧化剂浓度均为1 μmol/L)培养的细胞体外PDs均较对照组细胞有所下降，以姜黄素〔(46.0±3.2)代〕、大黄素〔(41.0±2.9)代〕培养基培养的细胞PDs下降最为显著(P<0.05)，提示上述抗氧化剂可能存在一定的细胞毒性。白藜芦醇〔(50.0±2.9)代〕、染料木黄酮〔(52.0±3.0)代〕与对照组〔(54.2±3.4)代〕无统计学差异(P>0.05)。

2.2四种抗氧化剂对2BS细胞生长增殖能力的影响 图1是不同浓度的药物培养基培养2BS细胞72 h后在490 nm处光吸收变化，结果显示白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素均在低浓度下促进细胞生长增殖，促进细胞生长增殖的最佳浓度分别是1.0 μmol/L、1.0～5.0 μmol/L、1.0 μmol/L。大黄素对2BS细胞生长增殖的促进作用不显著。随着浓度升高，四种抗氧化剂对细胞生长增殖能力的促进作用逐步下降，并在高浓度下表现出对细胞生长增殖的抑制作用。

图1 四种抗氧化剂对2BS细胞生长增殖能力的影响

2.3四种抗氧化剂对2BS细胞表型的影响 以1、10、50、100、200、500 μmol/L、1 mmol/L浓度的药物培养基培养28代龄2BS细胞3 d，细胞形态见图2。结果显示，随着抗氧化剂浓度升高，细胞胞体逐渐收缩、折光性逐渐下降，细胞融合速度减缓等，200 μmol/L白藜芦醇、500 μmol/L染料木黄酮、50 μmol/L姜黄素、10 μmol/L大黄素培养的细胞既可在显微镜下观察到细胞表型、融合速度的变化。

图2 四种抗氧化剂培养基培养28代龄2BS细胞3 d后的细胞形态及融合状况(×100)

2.4四种抗氧化剂对2BS细胞DNA损伤的影响 将30代龄2BS细胞，以不同浓度的含药DMEM培养基培养4 h(药物浓度梯度为10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L)，彗星实验结果见图3。结果显示，随着抗氧化剂浓度升高，彗尾长度逐渐增加，尤以姜黄素、大黄素最为明显，说明上述四种抗氧化剂在高浓度下均对DNA有一定的损伤作用。

图3 四种抗氧化剂培养基培养30代龄2BS细胞4 h彗星试验结果(×100)

3 讨 论

FR随龄累积，并通过脂质过氧化损伤细胞膜磷脂双分子层、DNA单链断裂或基因突变影响基因表达、染色体端粒缩短速度加快等加速细胞衰老〔2，9，10〕。前期研究发现，有效灭活FR可延缓细胞衰老〔3，4〕。白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素、大黄素富含于葡萄、大豆、生姜、大蒜等水果或食物中，且具有较强的抗氧化活性〔5～8〕，那么，上述抗氧化剂能否有效地延缓细胞衰老呢？本研究发现上述药物培养基培养的细胞PDs均低于对照组细胞，尤以大黄素培养的细胞传代次数最少，推测上述四种抗氧化剂可能同时存在延缓细胞衰老及抑制细胞衰老的双重效果。

细胞生长增殖能力是细胞衰老的主要生物学指标之一，本研究发现，白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素均在低浓度时显示了较好的促进细胞生长增殖效果，然而，随着浓度升高其对细胞生长增殖能力的促进作用逐步下降，并在高浓度下表现出对细胞生长增殖的抑制作用，而大黄素即使在低剂量条件下亦未显示对细胞生长增殖的促进作用。为验证上述结论，本研究以不同浓度的上述抗氧化剂培养细胞，发现低剂量时细胞生长状态良好、细胞融合速度优于对照组细胞，随着抗氧化剂浓度升高，细胞胞体逐渐收缩、折光性逐渐下降，细胞融合速度减缓等，从而验证了上述结论。提示上述抗氧化剂存在促进细胞生长和细胞毒性双重作用，且随剂量加大其双重作用均加大，低剂量抗氧化剂连续培养细胞时，细胞毒性随培养时间延长而累积，从而抵消了其对细胞生长增殖能力的促进效果。上述抗氧化剂细胞毒性的机制如何呢？本研究以不同浓度的抗氧化剂培养细胞，而后行彗星试验，发现随着抗氧化剂浓度的加大，彗尾长度逐渐加大、说明上述抗氧化剂可断裂单链DNA，且随着剂量加大其损伤作用愈强，提示上述四种抗氧化剂的细胞毒性基于其对细胞DNA损伤作用。

白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素、大黄素在低浓度时可促进细胞生长增殖，但存在基于损伤DNA的细胞毒性；上述四种抗氧化剂不能延缓细胞衰老，归因于其促进细胞增殖和细胞毒性的双重生物学作用。