五味子酚对心肌成纤维细胞增殖和转化生长因子β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响*

2018-11-29 05:42刘畅洪兰金红花
中国现代医学杂志 2018年33期
关键词:胶原蛋白纤维化心肌

刘畅,洪兰,金红花

(1.延边大学药学院 药剂学教研室,吉林 延吉 133002;2.延边大学医学院 生理学教研室,吉林 延吉 133002;3.延边大学附属医院 药学部,吉林 延吉 133000)

心肌纤维化是多种心脏相关类疾病病情不断发展所表现的具有共同特性的病理特征,是引起心室重塑的关键因素,其主要病理表现有心肌僵硬度增加、心肌收缩力下降、冠状动脉血流储备降低,甚至引起恶性心律失常和猝死[1]。近年来,针对心肌纤维化的治疗主要以西药为主,不仅会出现许多不良反应,治疗效果还不理想。对心肌纤维化的治疗,中国传统中药可以通过多种途径抑制心肌成纤维细胞(cardiacfibroblasts, CFb)增殖及胶原蛋白合成,并且取得了不错的效果,因此中药治疗心肌纤维化已成为国内外研究热点之一。

CFb是心脏非心肌细胞的主要组成,具有保护和支持心脏主体结构,协调心肌的舒缩功能,传达心肌细胞内信息等许多重要作用;CFb同时也是心肌纤维化过程中主要的效应细胞,它不仅自身具有较强的增殖分裂的能力,而且还可以合成分泌基质蛋白,因此在心脏发生心肌纤维化的过程中具有重要作用[2]。当心脏发生病理性病变时,CFb在多种因素的作用下发生增殖,同时还会分泌细胞外基质蛋白从而引起心脏间质纤维胶原大量合成积聚、胶原组成成分与比例发生改变、空间结构排列顺序发生紊乱,最终导致心肌纤维化。心肌纤维化的主要表现为细胞外基质发生严重失衡,心肌组织结构中胶原纤维大量沉积、胶原蛋白浓度明显升高,其中主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白显著增多,因此胶原蛋白过量沉积也是导致心肌纤维化的重要因素之一[3-5]。

血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是一种很强生物活性物质,是已知的最强缩血管的活性物质之一,其可通过中枢和外周机制,促进全身血管收缩、使血压升高,还可刺激肾上腺皮质球状带合成和分泌醛固酮,醛固酮也是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中另一重要生物活性物质,主要功能是调节钠水重吸收和钾的排泄。AngⅡ也是目前较公认的促心肌纤维化重要因素,可以引起CFb的增殖及胶原蛋白合成明显增加导致心肌纤维化。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是人体中重要的致纤维化细胞因子,参与调节成纤维细胞的增殖、分化、迁移和细胞外基质的生成[6-7]。

五味子酚(schisanhenol, Sal)是从中药五味子中提取的一类木脂素,是其主要的活性成分之一。具有降血压、抗氧化、保肝护肝和免疫调节的作用[8-10]。目前尚未报道sal对AngII诱导的CFb增殖的影响及抗心肌纤维化的研究。因此本实验研究Sal对AngⅡ诱导的CFb增殖及TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响,来探讨Sal抗心肌纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 出生1~3 d的SD乳鼠,雌雄不限,延边大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 Sal(购自上海原叶生物科技有限公司,批号为PJ0607SA13),AngⅡ(购自浙江嘉兴市雅玛试剂有限公司,批号为MAYA-CR-5721),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国Hyclone公司,Pen-Strep、DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶均购自美国Gibco公司,DAPI、BSA、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Sigma公司,Vimentin抗体、TGF-β1抗体及Collagen I、CollagenⅢ抗体购自英国Abcam公司,FITC的羊抗小鼠IgG抗体、HRP羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司,ECL显色液购自北京康为世纪生物科技有限公司,其他化学试剂为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 全波长酶标仪(美国Biotek公司),371型二氧化碳CO2培养箱(美国Thermo公司),Alpha化学发光凝胶分析成像系统(美国Protein Simple公司),U-RFL-T荧光显微镜和IX50倒置显微镜(日本Olympus公司),X-15离心机(美国Beckman Coulter公司),FD6型生物安全柜(意大利Bioair公司),电泳仪(美国Bio-rad公司),转膜仪(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 CFb的分离与培养 取1~3 d新生SD乳鼠10只,用75%酒精消毒,在无菌条件下开胸取出心脏,置入磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)中,将心脏剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织碎块,用0.25%胶原蛋白酶在37℃水浴下不断进行消化,每10 min收集1次消化悬液,共5次。弃第1次的消化悬液,其余每次收集的消化悬液加入等量的含有20%胎牛血清的培养液终止其消化,离心(1 200 r/min,5 min),弃上清液,收集沉淀。再加入含有20%胎牛血清的培养液制备成细胞悬液,接种培养皿中,差速贴壁60 min,去除其他细胞,待细胞成长接近95%时,按1∶3传代培养,实验采用2~5代细胞。

1.2.2 CFb的鉴定 将CFb放置在倒置显微镜下观察其生长状态。取1×105个2代CFb接种于放有无菌盖玻片的6孔板中,2~3 d后取出,用PBS洗3次,4%多聚甲醛固定细胞20 min,用PBS洗3次,0.5%聚乙二醇辛基苯基醚破膜20 min,用PBS洗3次,10% BSA封闭2 h,加入Vimentin抗体,4℃过夜。再用PBS洗3次,避光条件下加入标记FITC的山羊抗鼠IgG抗体,室温放置1 h,最后加入DAPI染细胞核,20 min后置于荧光显微镜下、观察。

1.2.3 MTT法测定CFb的增殖情况 将处在对数生长期的CFb以每孔0.5×104个接种在96孔板中,培养24 h后换无血清培养基,继续培养24 h后使细胞进入生长静止期,之后给予相应药物继续培养24 h。实验分组如下:①对照组,无血清的DMEM培养基;②模型组,含AngⅡ 100 nmol/L;③Sal组,含AngⅡ 100 nmol/L的Sal 3个剂量组(100、200及400 μmol/L)。之后每孔加MTT 20 μl(5 mg/ml),培养4 h,弃上清液,每孔加150 μl的DMSO,用酶联免疫仪在490 nm波长处检测光密度值(OD值)。细胞抑制率=(模型组OD值-Sal组OD值)/(模型组OD值-对照组OD值)×100%。

1.2.4 Western blot检测目的蛋白 将CFb接种于6孔板上,培养24 h后按实验要求加入处理因素,Sal组中Sal浓度分别为200、600及1 000 μmol/L,其他条件不变,处理时间为24 h。收集处理后的CFb,弃培养液,用少量PBS洗1次,每孔100 μl加入RIPA蛋白裂解液,冰上裂解,于4℃、13 000 r/min离心10 min,取上清液,目标蛋白按BCA蛋白试剂盒的说明书操作进行蛋白定量,加入4×上样缓冲液,100℃加热3 min使蛋白变性。目标蛋白用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上,选取目标条带,用5%脱脂奶粉封闭液进行室温封闭1 h,用PBST洗膜3次,每次10 min,然后分别加入Collagen I抗体、Collagen Ⅲ抗体、TGF-β1抗体,4℃过夜,用PBST洗涤后加入羊抗兔IgG酶标抗体,室温孵育2 h。分别进行Western blot分析,用ECL化学发光试剂盒显影,Alpha化学发光凝胶图像系统分析各蛋白条带灰度值,并以β-actin为内参标化各样品蛋白电泳条带的灰度值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,方差分析中的两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CFb形态学观察

倒置显微镜下观察,CFb的形态独特,呈长梭形或不规则三角形,细胞的中央有卵圆核,细胞胞质向外伸出突起,有的细胞呈交叉重叠生长,无自发性搏动。见图1A、B。

2.2 CFb免疫荧光鉴定情况

在荧光显微镜下观察,视野中的细胞绿色部分为Vimentin抗体的显色,蓝色部分为DAPI染色的非特异细胞核分布情况。Vimentin抗体表达阳性的细胞数占总细胞数目的95%以上。见图2。

图1 CFb的形态观察

图2 CFb免疫荧光鉴定

2.3 Sal对AngⅡ诱导的CFb增殖的影响

MTT法检测Sal对AngⅡ诱导CFb增殖的影响,经单因素方差分析,差异有统计学意义(P<0.05);模型组OD值与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);3个不同剂量Sal组的OD值与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见附表。

2.4 Sal对AngⅡ诱导的CFbⅠ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

各组的Collagen I表达水平,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=163.962,P=0.000),各组的Collagen I表达水平有差异。对照组Collagen I条带较细,与对照组比较,模型组、AngⅡ+200μmol/L Sal组、AngⅡ+600μmol/L Sal组的Collagen I灰度值增加,差异有统计学意义(P<0.05);AngⅡ+1000μmol/L Sal组的Collagen I蛋白表达无变化,差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,AngⅡ+200μmol/L Sal组、AngⅡ+600μmol/L Sal组、AngⅡ +1000μmol/L Sal组Collagen I灰度均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

附表 Sal对AngⅡ诱导的CFb增殖的影响 (n =6,±s)

附表 Sal对AngⅡ诱导的CFb增殖的影响 (n =6,±s)

注:1)与对照组比较,P <0.05;2)与模型组比较,P <0.05

组别 OD值 抑制率/%对照组 0.225±0.024 -模型组 0.546±0.0291) -Sal组 100 μmol/L 0.491±0.0482) 17.134 Sal组 200 μmol/L 0.438±0.0292) 33.644 Sal组 400 μmol/L 0.345±0.0222) 62.617 F值 131.365 P值 0.000

各组的Collagen Ⅲ表达水平,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=159.517,P=0.000),各组的Collagen Ⅲ表达水平有差异。对照组Collagen Ⅲ条带较细,与对照组比较,模型组、AngⅡ+200μmol/L Sal组、AngⅡ+600μmol/L Sal组的Collagen Ⅲ灰度值增加,差异有统计学意义(P<0.05);AngⅡ+1000μmol/L Sal组的Collagen Ⅲ蛋白表达无变化,差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,AngⅡ+200μmol/L Sal组、AngⅡ+600μmol/L Sal组、AngⅡ +1000μmol/L Sal组的Collagen Ⅲ灰度均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.5 Sal对AngⅡ诱导的CFb TGF-β1蛋白表达的影响

图3 Sal对AngⅡ诱导的Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白表达的影响 (n =6,±s)

各组的TGF-β1表达水平,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=241.489,P=0.000),各组的TGF-β1表达水平有差异。对照组TGF-β1条带较细,与对照组比较,AngⅡ+200μmol/L Sal组、AngⅡ +600μmol/L Sal组、AngⅡ +1000μmol/L Sal组的TGF-β1灰度值增加,差异有统计学意义(P<0.05);AngⅡ +1000μmol/L Sal组中 TGF-β1蛋白表达无变化,差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,AngⅡ+200μmol/L Sal组、AngⅡ+600μmol/L Sal组、AngⅡ+1000μmol/L Sal组TGF-β1灰度均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 Sal对AngⅡ诱导的TGF-β1蛋白表达的影响(n =6,±s)

3 讨论

心肌纤维化是心脏发生病理性病变时,心脏间质中的CFb过度增殖分化,细胞外基质胶原过度聚积及胶原蛋白比例失衡为特征的心脏间质重构。其中CFb对心肌纤维化有重要作用,主要通过其增殖分化成为肌成纤维细胞、分泌多种生物活性因子及细胞外基质而引起心肌纤维化。在此过程中,多种因素参与了CFb功能的调节。

在倒置显微镜下笔者发现,细胞呈长梭形或不规则三角形,中央有卵圆核,此形态为CFb特有形态。Vimentin是鉴定成纤维细胞的主要生物标志物;Vimentin抗体的阳性表达在图中显色成绿色,非特异性细胞核染色为蓝色,经观察CFb细胞数占总细胞数的95%以上,证实本实验分离的细胞为纯化的CFb。

本MMT实验结果显示,与对照组比较,模型组平均OD值增加,差异有统计学意义。说明AngⅡ作为公认的促心肌纤维化生物因子,浓度为100 nmol/L时可以促进CFb增殖。Sal各剂量组对AngⅡ所致的CFb增殖均有一定的抑制作用,且呈剂量依赖性。

CFb分泌的细胞外基质主要由胶原、糖蛋白、蛋白酶、细胞因子及生长因子等构成。其中的胶原主要是Ⅰ型和Ⅲ型,分别约占80%和10%,主要功能是支撑心脏整体骨架、传递信号到心肌细胞、调节心脏有规律收缩[11]。本结果显示,与对照组比较,药物处理24 h后,模型组的Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白表达量增加。说明100 nmol/L的AngⅡ不仅可以促进CFb的增殖,还可以促进由CFb分泌的细胞外基质中的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成。在Sal组中,不同浓度的Sal能抑制AngⅡ诱导后的CFb中Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白的表达;此外还发现,Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白表达的变化趋势与其有一定的相关性。说明Sal可以抑制AngⅡ诱导后CFb分泌的细胞外基质中的胶原蛋白合成。

TGF-β1是一组调节细胞生长和分化的细胞因子,它不仅参与正常机体组织代谢和功能维持,还在多种疾病病理生理过程中发挥重要作用。同时TGF-β1又是一类多效应的细胞因子,可以促进心脏成纤维细胞的增殖、分化;促进合成胶原蛋白的合成;抑制胶原的降解,同时对胶原酶原、基质酶原等产生抑制作用[12-13]。本研究发现,在药物处理24 h后,模型组中TGF-β1蛋白表达升高。说明在CFb中AngⅡ可以促进TGF-β1蛋白表达,而且TGF-β1蛋白量增加与CFb的增殖及胶原蛋白合成有关。初步证实TGF-β1相关信号通路参与了AngⅡ诱导新生大鼠心脏纤维化的过程。Sal可以下调AngⅡ诱导后CFb中TGF-β1蛋白表达且呈一定的剂量依赖性。

笔者通过以上研究发现,在AngⅡ诱导下,CFb中的TGF-β1、ColleageⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表达升高,其作用机制可能是AngⅡ诱导CFb合成TGF-β1,生成的TGF-β1反过来刺激CFb合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,大量的CFb增殖及细胞外基质堆积导致心肌纤维化。在Sal干预的蛋白表达中,TGF-β1、ColleageⅠ、Collagen Ⅲ蛋白降低且表达呈正相关。因此TGF-β1与ColleageⅠ、Collagen Ⅲ蛋白之间存在着相互调节关系。提示Sal对AngⅡ诱导CFb的增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的抑制作用部分是通过下调TGF-β1蛋白表达而实现的。

综上所述,Sal能抑制CFb增殖及降低Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达,而起到了抗心肌纤维化的作用,其机制可能与下调TGF-β1蛋白表达有关。阻断TGF-β1有可能成为预防和逆转心肌纤维化的一个重要靶点。

猜你喜欢
胶原蛋白纤维化心肌
胶原蛋白知多少
肝纤维化无创诊断研究进展
氧化槐定碱体内体外通过AKT/mTOR通路调控自噬抑制HBV诱发肝纤维化
高盐肥胖心肌重构防治有新策略
芪红水煎液抗大鼠免疫肝纤维化的作用机制
伴有心肌MRI延迟强化的应激性心肌病1例
大黄蛰虫丸对小鼠酒精性肝纤维化损伤的保护作用
想不到你是这样的胶原蛋白
根本没有植物胶原蛋白!
干细胞心肌修复的研究进展