miRNA-185和DNA甲基转移酶1在妊娠合并系统性红斑狼疮患者T细胞中的表达及其意义*

刘恩令，刘铮，周玉秀，李君，张冬红，蔡朝辉，王立群，陈梅，郑寰宇

（1.河北医科大学附属唐山市工人医院 妇产科，河北 唐山 063000；2.天津医科大学总医院 风湿免疫科，天津 300052；3.河北医科大学附属唐山市工人医院风湿免疫科，河北 唐山 063000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种常发于生育年龄妇女，影响多个器官的慢性自身免疫性疾病[1]。SLE主要在女性群体中发病，更常见于非洲裔女性[2]。生育年龄女性妊娠可导致流产、胎死宫内和宫内发育迟缓等，但经过孕前评估、孕期检测和免疫抑制治疗等措施，妊娠的结局可明显改善[3]。遗传，种族，激素和环境因素等都会影响到SLE的发生发展，发病机制为一种恶性循环的自身抗原暴露，产生自身抗体，导致慢性炎症和组织损伤[4-6]。越来越多的研究证实，表观遗传因素，特别是CD4+T细胞中异常的DNA甲基化模式，在SLE的发展中起着至关重要的作用[7]，最近的研究表明，miRNA-185可以直接靶向作用于DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1, DNMT1），从而导致全基因组甲基化（Genome DNA methylation, GDM）的减少和调控胶质瘤细胞中启动子-超甲基化基因的表达[8]。然而，miRNA-185如何通过调控DNMT1的表达和基因组DNA甲基化，从而影响SLE的发生发展的机制尚未有系统的探讨。本研究的主要目的是阐明miRNA-185及DNA甲基转移酶1在SLE患者的T细胞的表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择30例患有SLE的妊娠女性患者为实验组，平均（31.90±10.72）岁。对照组为30例健康女性的志愿者,平均（31.21±11.40）岁。对照组与实验组的年龄，性别和种族等均具有可比性，且均经河北医科大学附属唐山市工人医院伦理委员会批准和知情同意。所有患者都符合美国风湿病学会的SLE分类标准。用SLE疾病活动指数（SLEDAI）评估SLE活性。所有参与者都来自中国汉族人群。合并感染者被排除在研究之外。收集所有受试者外周血样本，用含有A型枸橼酸葡萄糖的采血管采集。

1.2 T细胞的分离、培养和转染

通过密度梯度离心分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC），通过磁珠阳性选择分离法分离CD4+T细胞，通过流式细胞术[平均纯度（95.5±1.21%）]进行纯度评估。分离得到的细胞在无血清培养基中培养。转染过程按照试剂盒的说明书进行操作，使用人T细胞Nucleofector试剂盒和Amaxa核转染技术（V-24程序），用FAM标记的miRNA瞬时转染CD4+T细胞。核转染后48 h分析DNMT1 mRNA和蛋白的表达，核转染后72 h检测甲基化敏感性基因的水平。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应检测CD4+T细胞中miRNA-185和DNMT1基因的表达

使用Trizol试剂按照说明书从细胞系中提取总RNA。使用PrimeScript RT Master Mix和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR试剂盒分别进行mRNA和miRNA的逆转录和实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）。所有反应都进行3组平行试验。通过U6和β-肌动蛋白对miRNA进行定量。根据2-ΔΔCt公式计算相对表达水平。引物如下：DNMT1，正向5'-CGGTTCTT CCTCCTGGAGAATGTCA-3'，反向5'-CACTGATAGC CCATGCGGACCA-3'；β-肌动蛋白，正向5'-GCACC ACACCTTCTACAATGAGC-3'，反向 5'-GGATAGCACA GCCTGGATAGCAAC-3'。miRNA-185和U6的引物购自上海Genepharm公司。

为验证DNMT1是否是miRNA-185的直接靶标，构建含有DNMT1 3'-UTR中miRNA-185的潜在结合位点的萤光素酶报告基因。分成miRNA-185模拟物、miNAR-185抑制剂和阴性对照组，然后将构建载体与miRNA-185模拟物miRNA-185抑制剂或阴性对照一起共转染到CD4+T细胞中，并在转染后48 h测量荧光素酶活性。

1.4 蛋白质印迹检测miRNA-185和DNMT1蛋白的表达

将细胞在补充有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中在冰上裂解30 min。10 000 r/min，4℃离心10 min至裂解液澄清。通过10% SDS-PAGE凝胶电泳分离等量的蛋白质并通过转移电泳将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。在含有0.1% Tween-20的Tris中用5%（W/V）脱脂牛奶封闭硝酸纤维素膜。将膜与一抗反应过夜，与共价结合有HRP的二抗在室温条件下反应1 h。用ECL技术观察条带。抗DNMT1抗体、抗CD11a抗体、抗CD70抗体和抗β-肌动蛋白抗体均购自美国Abcam公司。使用Quantity One软件定量相对表达水平。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行t检验或方差分析，方差分析的两两比较用Bonferroni法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 妊娠合并SLE患者的CD4+T细胞中miRNA-185表达与DNMT1的相关性

两组患者的CD4+T细胞中miRNA-185表达水平差异有统计学意义（t=3.732，P=0.0036），实验组高于对照组，见图1A。而DNMT1的结果正好相反（t=4.016，P=0.002），见图1B。此外，Pearson相关分析显示，miRNA-185的表达量与DNMT1表达量呈负相关（r=-0.8432，P=0.0000）,见图1C。

2.2 miRNA-185对DNMT1的靶向性

miRNA-185模拟物组miRNA-185表达高于其他两组（F=3.021，P=0.015），见图2A；miRNA-185抑制剂组miRNA-185表达低于其他两组（F=3.932，P=0.0027），见图2B。实验结果表明，miRNA-185能够抑制携带野生型3'-UTR的DNMT1报告基因载体的活性。蛋白质印迹结果显示，miRNA-185的过表达会降低DNMT1的蛋白水平（P＜0.05），而敲除miRNA-185则促进DNMT1蛋白水平的提高（P＜0.05），见图2C和2D。

2.3 miRNA-185的表达与全基因组DNA甲基化和CD11a和CD70表达的相关性

图1 妊娠合并SLE患者的CD4+ T细胞中miRNA-185和DNMT1 mRNA表达的相关性

图2 miRNA-185对DNMT1的靶向性

经过转染带有miRNA-185模拟物或阴性对照的CD4+T细胞，然后再转染72 h后测定DNA甲基化水平、CD11a和CD70的mRNA和蛋白质水平。如图3A所示，miRNA-185的上调降低全基因组DNA甲基化水平，并且增加CD11a和CD70的mRNA（见图3B）和蛋白质表达水平（见图3C）。另外，本研究采用亚硫酸氢盐测序来确定用miRNA-185转染CD4+T细胞后CD70和CD11a启动子的甲基化状态，结果发现，CD11a和CD70启动子的甲基化水平降低（见图3D），这与两种基因的mRNA和蛋白表达增加一致。

图3 miRNA-185的表达与CD11a和CD70表达的相关性

3 讨论

系统性红斑狼疮是累及多系统、多脏器的自身免疫性疾病，常导致多脏器损伤，而孕期可相互影响，妊娠可加重系统性红斑狼疮，导致脏器损伤加重，而狼疮可导致不良妊娠结局，甚至母婴死亡的危险[9]。而导致狼疮患者母婴不良结局的机制尚不清楚。DNA甲基化是染色质结构的基本决定因素，对基因表达具有有效的抑制作用。最近研究表明，T细胞DNA去甲基化在SLE的发病机制中起着重要的作用[10]。用肼苯达嗪、普鲁卡因酰胺、5-氮胞苷（5-azaC）等DNA甲基化抑制剂处理鼠或人T细胞后，可以诱发狼疮样综合征，而停用该药物后，症状逐渐消退[l1-12]，证明T细胞DNA低甲基化可能在SLE发病中起作用。DNA甲基转移酶（DNMTs）是基因组甲基化状态和强度的关键调节因子。目前，已经确定3种具有催化活性的DNMT，即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B[13]。DNMT1是基础性表达基因，在DNA复制期间负责DNA甲基化的正常进行。本研究通过检测妊娠合并SLE患者的T细胞样本，发现miRNA-185在CD4+细胞中表达上调。从机制上看，miRNA-185与SLE中的DNA低甲基化有关，通过直接抑制DNMT1的表达参与SLE的发病机制。

在本研究中笔者还发现，来自健康对照的CD4+T细胞中miRNA-185的过表达会导致全基因组DNA和CD11a和CD70基因启动子甲基化程度下调，其他相关基因的上调。如果敲除SLE患者的CD4+T细胞中的miRNA-185，会提高DNMT1的表达，可降低甲基化敏感性基因的表达。综合整个实验结果发现，或许可以认为干预miRNA-185的表达水平，从而为SLE提供有效的干预治疗方案。

总之，妊娠合并SLE患者的CD4+T细胞中miRNA-185的表达量增加，并且与DNMT1的表达呈负相关，miRNA-185可直接降低DNMT1的表达水平，从而导致DNA的低甲基化和甲基化敏感性基因的过度表达，介导SLE的发病机制。因此，本研究为SLE的干预治疗提供了新的策略，从而为进一步改善此类患者的预后提供理论依据。