背根神经节巨噬细胞迁移抑制因子参与调控神经病理性疼痛的机制研究*

龙迎曦，唐轶珣，黄晓玲，潘冰冰，刘永平，魏来，孔高茵

[湖南省人民医院（湖南师范大学附属第一医院） 麻醉科（湖南省围术期加速康复麻醉临床医学研究中心），湖南 长沙410005]

神经病理性疼痛困扰全世界约1.0～5.6亿人，其病因复杂，疼痛程度严重，给患者带来极大的痛苦[1-2]。因此，为深入研究神经病理性疼痛产生的机制，学者们建立许多重复性好、临床模拟度高的动物模型，其中最经典的是慢性坐骨神经压迫（chronic constriction injury, CCI）模型。基于动物模型和临床层面的研究提示，炎症反应、神经受损后的异常放电、胶质细胞的活化和中枢及外周的敏化是神经病理性疼痛的主要机制[2-4]。其中，炎症反应是导致神经病理性疼痛形成的重要机制[5]。当外周神经受损时，背根神经节上的炎症反应激活胶质细胞，导致神经细胞的敏化[5]。因此，以神经受损后产生的炎症反应为靶向目标，给神经病理性疼痛的治疗带来广阔的前景。

巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）是第一个被发现在免疫性炎症中发挥多效炎症介质功能的细胞因子，可由免疫细胞如巨噬细胞、B细胞以及非免疫细胞如内皮细胞等合成，它主要通过抑制巨噬细胞游走，增强巨噬细胞的吞噬、内杀伤等作用促进炎症反应[6]。本研究复制CCI模型，通过观察鞘内注射MIF拮抗剂ISO-1对CCI大鼠机械痛阈、脊髓背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）MIF、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）表达变化、坐骨神经电生理的影响，探讨DRG中MIF参与调控神经病理性疼痛的机制，从炎症机制的角度为开发特异性高、镇痛效果良好的新型药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10%水合氯醛（购自湖南省人民医院），MIF拮抗体剂ISO-1（MIF拮抗剂）购自德国Calbiochem公司，TNF-α及IL-1β ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），小鼠单克隆Anti-MIF抗体和大鼠单克隆Anti-GAPDH抗体购自Santa Cruz公司，电子von Frey测痛仪（型号2390）购自美国IITC。

1.2 动物及分组

24只无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠，由湖南省人民医院动物实验中心代购，体重220～250 g，饲养于24℃室温条件下，相对湿度50%～60%，自由摄食和饮水。随机分为3组，每组8只：假手术组（Sham组）；CCI组（CCI术后，鞘内连续注射溶剂——10%DMSO 10 μl 14 d）；ISO-1组（CCI术后，鞘内连续注射含 ISO-1 30 μg的 10% DMSO 10 μl 14 d）。该实验所有与动物饲养和操作都遵循国际动物保护协会和国际疼痛研究学会的相关规定，并经湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院伦理委员会批准（伦理批号：2016年009号）。

1.3 鞘内置管

腹腔注射10%水合氯醛麻醉（剂量350 mg/kg）。刺激大鼠无体动后，置大鼠于俯卧位，通过髂棘定位于L3～L4间隙，去毛，使用络合碘消毒，作长2～3 cm的纵切口，分离L4棘突两侧肌肉，切除L4棘突和邻近椎板，定位L3与L4棘突间隙，置入25 G针，穿破黄韧带及硬脊膜后，可见脑脊液溢出。经破口处插入PE-10导管2 cm，18 G硬膜外穿刺针在大鼠皮下穿一隧道，导管的另一端送至颈背部，外露2～3 cm固定，外口封闭，防止脑脊液外溢。排除置管时瘫痪的大鼠（可能为脊髓受损所致，出现概率约为20%）。术后于伤口处涂抹金霉素软膏，并于术后3 d肌内注射青霉素1万IU/d抗感染。置管后第3天，导管内注射2%利多卡因20 μl。若出现下肢瘫痪，且30～40 min左右恢复，即提示鞘内置管成功。每次注药时，使用微量注射器（规格50 μl）给药10 μl，注射时间为20 s，再用10μl生理盐水冲管，确保药液完全进入鞘内。

1.4 CCI模型的复制

按照BENNET等人的方法制备大鼠左后肢CCI模型[7]，方法如下：大鼠鞘内置管5 d后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（剂量350 mg/kg）。刺激大鼠无体动后，置大鼠于俯卧位，在左股骨外侧切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，用4-0铬制羊肠线松结扎坐骨神经干4道，每道间距为1 mm。小腿肌肉轻度颤动且不影响神经外膜血运的结扎强度为最佳。术毕使用金霉素眼膏涂抹伤口，并使用青霉素肌内注射1万IU/d，抗感染3 d。术后单笼饲养，加强营养。Sham组大鼠仅暴露坐骨神经不进行结扎。

1.5 机械痛阈测定

在术前1天，术后第1、3、5、7、10及14天（鞘内给药2 h后）测定各组大鼠机械痛阈值（术前1天，术后第1、3、5及7天测8只大鼠机械痛阈值；由于第7天每组处死4只大鼠取组织，因此术后第10和14天测余下4只大鼠机械痛阈值）：将大鼠放置于距实验台高30 cm的铁丝网架上，大鼠适应且处于安静状态后，用电子von Frey痛阈测定仪探头接触小鼠患侧肢体足底中央，缓慢增加压力直至肢体抬起。此时仪器的读数为小鼠机械性缩足阈值。每只动物测5次，取平均值。

1.6 ELISA检测脊髓背根神经节炎症因子TNF-α、IL-1β的浓度

于术后第7和14天，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，采用颈椎脱臼法，每组各处死大鼠4只，沿棘突切开皮肤，剪除棘突和椎板，快速取出取各组大鼠左侧L4～6脊髓DRG，置于EP管中，置入-80℃冰箱冷冻保存。

检测前将脊髓DRG取出，称质量，标本放入4℃、pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，制成匀浆液，4℃下20 000 r/min离心30 min，取上清液（主要含有非膜结合TNF-α），置于4℃冰箱中保存；再用pH=7.4的PBS悬浮上述离心后的沉淀，4℃孵育1 h，然后4℃下20 000 r/min离心20 min，取上清液（主要含膜结合的TNF-α）。两上清液之和即为各组织中的总TNF-α含量，混匀待测。采用ELISA试剂盒检测TNF-α浓度，Bio-Rad酶标仪测定450 nm波长处吸光度（A）值，根据标准曲线计算TNF-α相对浓度，结果以pg/mg表示。

检测前将脊髓DRG取出，称重量，然后将其置于4℃、pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，制成匀浆液。使用玻璃匀浆器在4℃下匀浆，4 ℃下20 000 r/min离心30 min，取上清液。按照ELISA试剂盒提供的标准步骤测定IL-1β浓度，Bio-Rad酶标仪测定450 nm波长处吸光度（A）值，根据标准曲线计算IL-1β相对浓度，结果以pg/mg表示。

1.7 Western blot检测患肢侧背根神经节MIF的表达

于术后第7和14天，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，沿棘突切开皮肤除棘突和椎板，快速取出取各组大鼠左侧L4～6脊髓DRG，取出已收集的脊髓DRG，加入组织裂解液，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度。取50 μl蛋白行SDS-PAGE电泳，转膜，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，加入MIF抗体（1∶1 000稀释）4℃下孵育过夜。重复清洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗工作液（羊抗兔1∶2 000），室温下孵育1 h，增强化学发光显色，采用Alpha Innotech光密度分析软件，以GAPDH为内参进行定量分析，每组重复检测3次。图像分析软件定量分析靶蛋白及内参GAPDH条带含量，计算MIF/GAPDH比值，进行统计分析。

1.8 大鼠坐骨神经传导速度测定

于术后第14天测定大鼠坐骨神经的传导速度（conduction velocity, CV）（n=4）。采用 BL-420E 生物机能实验系统软件（成都泰盟公司）肌肉神经实验中神经干兴奋传导速度测定模块，刺激并记录动作电位。腹腔注射10%水合氯醛麻醉（350 mg/kg）。刺激大鼠无体动后，置大鼠于俯卧位固定，切开皮肤，分离肌肉，充分暴露结扎段坐骨神经。游离出坐骨神经干，用两绝缘电极分别勾于结扎坐骨神经处的近端和远端（两绝缘电极距离为2 cm），其中刺激电极位于记录电极的远端。接地线连接的钳夹夹住皮肤。确认接触良好后，施加电刺激，找出诱发稳定动作电位的最大刺激，记录到稳定的动作电位后，记录潜伏期（两电极之间的距离刺激伪迹出现至动作电位的起始部）。并计算出（CV）。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，配对t检验，单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，方差分析的两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ISO-1对CCI大鼠机械痛敏的影响

3组大鼠在术前1天的机械痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05）。3组大鼠术后第1、3、5及7天的机械痛阈值，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的机械痛阈值有差异（F=22.843，P=0.000）；②3组大鼠机械痛阈值有差异（F=58.170，P=0.000）；③3组大鼠的机械痛阈值变化趋势有差异（F=37.413，P=0.000）。见表1。3组大鼠术后第10和14天的机械痛阈值有差异（第7天：F=139.399，P=0.000；第14天：F=246.908，P=0.000）；与Sham组比较，CCI组大鼠机械痛阈值均降低（P＜0.05）；与CCI组比较，ISO-1组大鼠机械痛阈值均升高（P＜0.05）。见表2。

表1 各组大鼠各时间点机械痛阈值比较 （n =8，±s）

表1 各组大鼠各时间点机械痛阈值比较 （n =8，±s）

组别 术前1天 术后第1天 术后第3天 术后第5天 术后第7天Sham 组 13.65±1.66 13.26±1.39 12.81±1.54 14.13±1.92 13.60±1.87 CCI组 13.00±1.49 5.12±0.90 4.10±0.68 4.56±0.84 4.23±0.78 ISO-1 组 13.16±1.08 4.99±1.08 4.20±1.22 4.99±1.08 4.20±1.22

表2 各组大鼠术后第7和14天的机械痛阈值比较（n =4，±s）

表2 各组大鼠术后第7和14天的机械痛阈值比较（n =4，±s）

组别 术后第7天 术后第14天Sham 组 13.26±1.39 12.81±1.54 CCI组 5.12±0.90 4.1±0.68 ISO-1组 10.85±1.33 10.45±1.24 F值 139.399 246.908 P值 0.000 0.000

2.2 ISO-1对CCI大鼠脊髓背根神经节炎症细胞因子IL-1β、TNF-α表达的影响

第7和14天，3组大鼠IL-1β表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham组比较，在术后第7和14天，CCI组大鼠DRG中IL-1β表达均升高（P＜0.05）；与CCI组比较，术后第7和14天，ISO-1组大鼠DRG中IL-1β表达均下调（P＜0.05）；与Sham组比较，术后第7天，ISO-1组大鼠DRG处IL-1β表达增加（P＜0.05），术后第14天，ISO-1组大鼠DRG中IL-1β表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

第7和14天，3组大鼠TNF-α表达差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham组比较，在术后第7和14天，CCI组大鼠DRG中TNF-α表达升高（P＜0.05）；与CCI组比较，术后第7和14天，ISO-1组大鼠DRG中TNF-α表达下调（P＜0.05）。与Sham组比较，术后第7和14天，ISO-1组大鼠DRG中TNF-α表达增加（P＜0.05）。见表4。

表3 各组大鼠术后第7和14天的IL-1β表达（n =4，±s）

表3 各组大鼠术后第7和14天的IL-1β表达（n =4，±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与CCI组比较，P ＜0.05

组别 术后第7天 术后第14天Sham 组 6.28±0.72 6.18±0.97 CCI组 17.42±0.781） 15.62±0.651）ISO-1 组 9.0±0.581）2） 6.96±0.982）F值 345.619 177.345 P值 0.000 0.000

2.3 ISO-1对CCI大鼠脊髓背根神经节MIF表达的影响

术后第7和14天，3组大鼠MIF表达差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham组比较，术后第7和14天CCI组大鼠DRG中MIF表达均升高（P＜0.05）。与CCI组比较，ISO-1组大鼠术后第7和14天DRG中MIF表达均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham组比较，ISO-1组大鼠术后第7天DRG中MIF表达无变化（P＞0.05），第 14 天表达增加（P＜0.05）。见表5和图1。

2.4 ISO-1对CCI大鼠坐骨神经CV的影响

3组大鼠坐骨神经CV的比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=7 481.400，P=0.000）；与Sham组比较，CCI大鼠坐骨神经CV降低（P＜0.05），与CCI组比较，ISO-1组大鼠坐骨神经CV差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

表4 各组大鼠术后第7、14天的TNF-α表达（n =4，±s）

表4 各组大鼠术后第7、14天的TNF-α表达（n =4，±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与CCI组比较，P ＜0.05

组别 术后第7天 术后第14天Sham 组 2.34±0.73 2.50±0.61 CCI组 8.08±0.741） 7.1±0.721）ISO-1 组 4.14±0.551）2） 3.98±0.591）2）F值 93.140 70.505 P值 0.000 0.000

表5 各组大鼠术后第7和14天的MIF表达（n =4，±s）

表5 各组大鼠术后第7和14天的MIF表达（n =4，±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与CCI组比较，P ＜0.05

组别 术后第7天 术后第14天Sham 组 0.14±0.006 0.13±0.02 CCI组 0.80±0.011） 0.87±0.041）ISO-1 组 0.13±0.0052） 0.29±0.051）2）F值 7 481.400 320.773 P值 0.000 0.000

图1 各组大鼠DRG中MIF的表达

图2 各组大鼠坐骨神经CV比较

3 讨论

本研究显示，坐骨神经损伤后，受损部位的动作电位的传导速度减慢，患肢表现出机械痛觉过敏，同时相应DRG中MIF及炎症细胞因子IL-1β、TNF-α表达上调。鞘内注射ISO-1能减轻CCI大鼠患肢的机械痛觉过敏，下调患肢相应的DRG中MIF、IL-1β及TNF-α的表达，但不能改善受损神经的传导速度。本结果揭示MIF通过上调DRG中炎症反应参与调控神经病理性疼痛的形成。

MIF是一种多功能的促炎因子之一，与多种疾病相关[8]。神经受损后中枢和外周神经系统中的MIF表达改变提示其参与神经元的变性和再生的调节[9]。DRG是外周痛觉信息传入的第一级神经元，组织损伤后，神经胶质细胞和施旺细胞被激活并释放一系列炎症细胞因子，导致炎症的发生；该细胞的激活也导致疼痛介质的产生，降低动作电位的阈值，使胶质细胞敏化，导致外周和中枢敏化，从而导致慢性神经病理神经痛形成[10]。笔者通过结扎大鼠左侧的坐骨神经复制CCI模型，行为学结果显示，CCI术后，大鼠有稳定的机械痛阈降低。蛋白印迹检测证明同侧DRG中MIF表达上调与CCI诱导的疼痛密切相关，且表现出时间依赖性。既往研究证实，在神经病理性疼痛中，脊髓背角MIF表达也升高[11]。上述结果提示，MIF在脊髓背角和DRG 2个层面都与神经病理性疼痛的形成相关。既往研究证实，ISO-1 30 μg能抑制炎性痛[12]，在笔者的前期实验中，发现该剂量也能抑制CCI大鼠的机械痛敏。鞘内注射ISO-1后，术后第1和3天实验动物的机械痛阈并未增加，提示此剂量的ISO-1的镇痛效应出现在观察期的中晚期。既往研究证实，在炎症或神经病理性疼痛模型中，脊髓背角小神经胶质细胞和神经元可能是炎性和神经病性情况下MIF表达上调的主要来源[11]。然而，在背根神经节中，是否存在者不同细胞的表达差异，有待进一步探究。

炎症细胞因子导致的神经炎症在神经病理性疼痛的发生、发展中越来越受到关注。其中在背根神经节层面，促炎因子IL-1β和TNF-α与神经病理性疼痛关系的研究较多。IL-1β可通过作用于辣椒素受体和IL-1R受体作用于p38 MAPK通路诱发疼痛[13]；TNF-α通过激活p38 MAPK通路促进Na+内流，降低兴奋性阈值，还可与受体结合后激活细胞NF-κB，引起炎症级联反应，促进疼痛的产生[14]。而作为重要的促炎因子，MIF可通过cPLA2-COX2通路调节小胶质细胞中其他炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6的表达[14]。本实验中，鞘内注射ISO-1可抑制DRG中TNF-α、IL-1β的表达。因此，MIF可能是促使疼痛形成的神经炎症级联反应中的上游介质。

神经电生理指标是评估神经受损、功能状态最客观的指标。其中，神经CV是神经冲动传导的直接表现。在本实验中，使用神经电生理技术测量实验动物受损坐骨神经的动作电位传导速度，结果显示，与CCI组比较，ISO-1组的坐骨神经CV并未改善。笔者推测，鞘内注射ISO-1通过抑制脊髓和DRG中MIF的促炎作用，从而减轻CCI模型大鼠的机械痛敏，但并不能修复受损的坐骨神经。但在受损神经局部使用ISO-1处理是否能改善坐骨神经的功能，将在进一步的实验中探索。

本研究存在以下不足：首先，DRG中不同细胞对神经病理性疼痛的贡献不一，该研究并未从细胞层面去探究相关细胞的活化状态与MIF的表达关系。其次，在该研究中，鞘内注射ISO-1并未完全缓解CCI大鼠的疼痛，有可能与ISO-1的剂量相关，也可能与存在其他的机制参与CCI大鼠的痛觉形成有关。因此，在下一阶段的研究中，笔者将从上述的不足着手，对背根神经节MIF参与调控神经病理性疼痛的机制进行更深一步的研究。

综上所述，MIF可能通过上调炎症细胞因子的表达参与神经病理性疼痛的形成。因此，从炎症角度，针对MIF拮抗剂的研究将为神经病理性疼痛的治疗提供新视角。