BALB/c小鼠对马尔尼菲篮状菌黑素的免疫应答

孙 弦 刘 睿 吴 庭 刘栋华

马尔尼菲篮状菌(Talaromrces Marneffei, TM)原名为马尔尼菲青霉(Penicillium Marneffei, PM)是一种可致人类感染罹患马尔尼菲篮状菌病(Talaromycosis Penicilliosis Marneffei, TSM)的深部真菌，具有温度双相性。25℃呈菌丝相，产红色素；37℃呈酵母相，产黑色素[1,2]。TSM患者已分布我国多地，为艾滋病、恶性肿瘤、免疫功能低下患者中较为常见的机会性感染[3,4]，病情极为凶险复杂，死亡率高。前期研究表明，黑素是多种致病真菌的毒力因子，能降低对抗真菌药物的敏感性，且TM酵母细胞在体外可利用左旋多巴合成多巴型黑素[5]。本研究将以TM黑素颗粒作为抗原，经腹腔多次免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术来制备单抗，旨在探讨TM黑素能否刺激机体产生免疫应答。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，重约20 g。

1.1.2 细胞株 SP2/0-Ag14，中科院上海生命科学研究院。

1.1.3 主要试剂 RPMI-1640培养基(维森特生物技术有限公司)，HT/HAT培养基、FCA/FIA佐剂、人工合成黑素(美国Sigma公司)，牛血清白蛋白、PEG4000(Biosharp公司)，兔抗鼠IgG(SouthernBiotech公司)，羊抗人IgG (北京博奥森生物技术有限公司)

1.1.4 仪器 倒置显微镜(美国OLYMPUS公司)，酶标仪、CO2培养箱(美国赛默飞世尔科技)

1.2 方法

1.2.1 抗原的提取 收集黑素化后的TM酵母细胞，通过溶壁酶、变性剂、蛋白酶、浓酸、强碱等步骤处理，获取纯化的TM多巴黑素颗粒，冷藏备用。

1.2.2 动物免疫 小鼠随机分组，将TM黑素(100 μg、200 μg、300 μg、500 μg)与弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂充分乳化，经小鼠腹腔注射，0.5～1 mL/只。设生理盐水和人工合成黑素(100 μg)为空白和阳性对照组。共接种4次，间隔3周，历时约3个月。收集小鼠腹水及血清-20℃贮存。

1.2.3 细胞融合反应 取免疫小鼠脾细胞悬液和SP2/0细胞(按5∶1或10∶1)在50%聚乙二醇溶液介导下融合，置96孔板(100 μL/孔)，37℃ CO2培养箱中孵育。3天后倒置显微镜下逐日观察，待细胞集落长至1/3～1/4每孔时，收集上清液检测。

1.2.4 抗体特异性检测

1.2.4.1 直接凝集反应 稀释TM黑素至20 μg/mL，于孔板内与免疫小鼠腹水、血清、杂交瘤细胞培养上清液行抗原-抗体反应，摇床水平、匀速、轻摇约5～8 min，记录有无凝集现象。

1.2.4.2 间接ELISA法 将TM黑素包被于96孔酶标板中，0.1 mL/孔，检测免疫小鼠腹水、血清、杂交瘤细胞培养上清液中抗体的含量，加入酶结合物兔抗鼠IgG(1：4000)，用酶标比色计测定OD值(TMB 450 nm)。

2 结果

2.1 小鼠免疫后的情况 免疫小鼠出现不同程度的行为、形体及脏器改变，包括反应迟缓、脱毛、腹水，以及脾脏肿大(图1)等。

2.2 细胞融合反应 融合第3天起成批SP2/0细胞逐渐缩小，核固缩、碎裂，进而凋亡；巨噬细胞(小鼠腹腔细胞)开始增生、肥大，吞噬周围细胞碎片及杂物。1周左右，单个SP2/0细胞或小鼠脾细胞大量死亡，镜下可见一种圆形、核较大、成团生长的细胞(图2)，即为杂交瘤细胞，并不断分裂、增殖。

2.3 抗体检测

2.3.1 直接凝集试验 免疫小鼠血清与TM黑素颗粒自然聚集(图3)，正常小鼠则均匀分散，并未见凝集现象(图4)。免疫小鼠的腹水和杂交瘤细胞上清也得出相同结论。另外，选取两例临床TSM患者血清与TM黑素颗粒反应，亦出现凝集现象。

2.3.2 间接ELISA法 添加显色剂TMB后，肉眼可见免疫小鼠腹水、血清以及细胞培养上清液所在孔的颜色较正常小鼠和空白组而言，明显加深。酶标仪内测得450 nm处的OD值依次为1.635±0.085、1.820±0.249、0.671±0.142。

图1 免疫小鼠脾脏肿大 图2 融合反应第7天镜下观(×200) 图3 直接凝集反应(×100) 图4 直接凝集反应(×100，正常小鼠)

3 讨论

TM主要侵犯人体的单核巨噬系统，可致发热、消瘦、贫血、肝脾肿大、肺部感染、淋巴结肿大、关节疼痛、皮疹等临床表现，常缺乏特异性，极易误诊、漏诊[6]。目前确诊TSM的重要手段为真菌培养或病理检查，但真菌培养周期长且阳性率低，而病理诊断易与其它细胞内病原真菌相混淆。当今，单抗技术早已广泛运用于真菌学领域，但尚无一种快速、高效、特异性强的方法来检测TM抗原。Chaiyaroj等[7]制备了两株TM单抗经ELISA法来检测TM感染，其敏感性、特异性和准确性分别是92.45%，97.5%，96.59%。Panichakul等[8]用单抗8C3克隆株经ELISA夹心法检测临床TM感染患者血液及尿液中的抗原，发现有较高敏感性和特异性。

本实验在3个月内用TM黑素对BALB/c小鼠多次免疫接种，观察发现，免疫小鼠有不同程度的形体和行为变化，如脱毛、腹部膨隆、行走缓慢、嗜睡等，解剖后见腹腔内弥漫性腹水，实质性和空腔脏器肿大，包膜增厚及系膜纤维结缔组织增生、黏连，以脾脏为重。初步说明TM黑素具有较强的免疫原性，能刺激小鼠产生强烈的免疫应答。当TM黑素量为100 μg时，小鼠就已存在以上反应，当增至500 μg时也未加重或死亡，证明TM黑素在这个区间尚不具备致死性。另外，有学者采用小鼠脾脏内注射免疫，可缩短免疫接种周期，节省了时间、人力、物力，但注射难度大。

经融合反应，在选择性培养基里有一类细胞存活下来，通过凝集试验、ELISA法对其培养上清液进行检测，部分孔出现凝集现象或OD升高的情况，由此证明杂交瘤细胞形成可能。收集阳性孔的瘤细胞扩大化培养，注射到正常小鼠腹腔，抽取腹水后检测，亦得出相似结论。这与Nosanchuk等[9]利用新型隐球菌黑素制备单抗时基本一致。

研究表明，黑素有保护菌体免受宿主巨噬细胞吞噬及氧化杀伤的作用，感染后可引起宿主强烈的免疫应答。Rosas等[10]给感染新型隐球菌的小鼠注射抗黑素单抗，发现能减轻被感染小鼠菌负荷量，且延长了被感染小鼠的生存时间。接下来，实验组会利用TM黑素抗体来检测临床TSM患者治疗前后的血清中抗体滴度的变化，了解其是否可以作为评判TSM预后的标准之一，另将通过动物实验来探索TM黑素抗体能否增强小鼠对TM感染的抵抗力。本次实验虽然获取了杂交瘤细胞，证明了TM黑素的免疫原性，但检测时发现其阳性反应灵敏度不甚理想，有待更进一步的摸索与验证。我们将TM黑素与临床隐球菌感染患者血清进行凝集试验，并未出现明显凝集现象，提示TM黑素可能具有一定特异性。毋庸置疑的是，TM黑素抗体的应用研究对临床工作具有极为重要的理论价值和实用价值，对TSM诊断和治疗有指导意义。