低剂量丙烯酰胺多世代持续暴露对秀丽隐杆线虫的损伤作用

屠泽慧，聂文，郭肖颖，蔡克周,*

1. 合肥工业大学食品科学与工程学院，农产品精深加工安徽省重点实验室，合肥 230009 2. 安徽省农业科学院农业工程研究所，合肥 230031

丙烯酰胺(acrylamide, AA)是聚丙烯酰胺的单体[1]，广泛应用于造纸、染料、塑料和水处理等工业过程[2]。AA对动物生殖系统和神经系统具有毒性[3]，还可诱发小鼠、大鼠和斑马鱼等多种动物肿瘤[4-5]，也是一种可能的人类致癌物(2A类)[6]。2002年，AA最先在普通食用的食物中被发现，这些AA主要是由食物中游离的天冬酰胺和还原糖在高温条件通过美拉德反应形成[7-8]。美国食品和药物管理局和欧洲食品安全委员会对丙烯酰胺暴露进行了评价，认为食品是人体丙烯酰胺主要暴露源[9]。而在中国，组织抽查的144个食品样本中AA检出率达43.7%[10]。

尽管由于食品摄入造成AA对人的广泛暴露，但由于饮食习惯和食物结构的不同，AA暴露的剂量存在较大差异，就单个人而言每天饮食摄入量多在μg级别，这种饮食水平AA暴露的生物学毒性研究相对较少。Jin等[11]报道饮食水平的AA暴露可诱发氧化应激和炎症，Walters等[12]发现低水平的AA可以诱发原代心肌细胞功能异常，Claudio则认为子宫内膜癌和低水平的AA暴露没有直接的关联[13]。现有关于低水平AA生物学毒性多在离体培养细胞上开展，存在相对较短的暴露处理时间，而长时间低剂量，特别是饮食水平的AA在生物上的连续多世代的暴露，在世代上的积累效应目前还没有研究。现有常规动物学模型如小鼠和大鼠相对较长的繁殖周期也限制了这一研究的开展。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)是现有毒理学研究中的一种经典模式生物[14]。通过基因改造和新的生物学终点的尝试，秀丽隐杆线虫已经广泛应用于环境因子评估和生态毒理等方面的研究[15-16]。作为一种活体生物模型，其3～4 d相对较短的生殖周期和4周左右的寿命[17]，是一种开展化学污染物多世代持续暴露生物学毒性评价的好模型，选取简单、直接、易测的生物学终点是利用好模式生物的重要前提，线虫发育状况、繁殖性能、寿命和摄食行为等生物学终点被广泛应用于重金属[18]、农残[19]、化学药物[20]、空气负离子[21]和活性提取物[22]的毒理和活性评价。本实验选择秀丽隐杆线虫发育周期、后代数量、寿命和摄食行为为生物学终点，研究低浓度AA多世代持续暴露的生物学毒性，为AA合理评估提供更多理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试剂与线虫

AA(超纯级，≥ 99.9%)购买于阿拉丁试剂公司，使用时先配制成0.1 mol·L-1溶液过滤灭菌后分装在1.5 mL离心管，每次使用前取样稀释。

实验所用的野生型秀丽隐杆线虫N2和线虫食物大肠杆菌OP50由国际线虫中心(CaenorhabditisGenetics Center, CGC)提供。在实验室里，线虫正常在(20±1) ℃温度范围内培养。

1.2 线虫的同步化处理[21]

用KM培养液(2.922 g NaCl, 2.236 g KCl，溶于1 000 mL双蒸水，高压灭菌)将怀卵成虫从NGM平板洗下，加入到1.5 mL离心管中，使总体积达到0.7 mL，然后加入0.3 mL裂解液(5 mol·L-1NaOH∶5% NaClO = 1∶2，V/V，现配现用)，间歇弹击混匀，裂解结束后立即在1 400 g离心力下离心，移上清，再用KM清洗2次，最后将虫卵于KM中过夜孵化，由于没有添加食物，线虫全部滞留在L1期。

1.3 线虫发育周期的测定

AA暴露对线虫发育周期的影响，参照Lin的方法[23]，将7～9只怀卵的成虫分别移入Ф35 mm含0.0、0.01、0.1和1.0 mmol·L-1AA的NGM平板上培养1 h，收集约30只虫卵，将成虫移走，此时记时为0 h，48 h之后每隔2 h在解剖镜下观察，直至有新虫卵出现，间隔时间为线虫发育周期。

选取适宜的AA浓度，然后再检测AA多世代持续暴露对线虫发育周期的影响，将7～9只怀卵的成虫移入对应的NGM板中培养，检测g0代发育周期，再挑选7～9只g0代怀孕线虫进行相同处理，测定g1代发育周期，g2和g3代发育周期测定同上。对照组在不添加AA的NGM板上测定。每次试验至少10个平行处理，重复3次。

1.4 线虫寿命的测定

AA暴露对线虫寿命的影响，参照Lin的方法[23]，将同步化早期成虫分别单个移入Ф35 mm含0.0、0.001、0.01和0.1 mmol·L-1AA的NGM板上培养，此时记为0 d，以后每天将线虫移入新的平板，直至不再产卵，为保证有新鲜的食物和稳定的AA浓度，每3天将线虫重新转板，直至死亡，间隔天数即为寿命。

选取适宜的AA浓度，将单个早期成虫分别移入对应的NGM板中培养，检测g0代寿命，再从g0下一代中挑选早期成虫，测定g1代线虫寿命，g2和g3代寿命测定同上，对照组在不添加AA的NGM板上测定。所有在培养期间钻入琼脂和爬壁上死亡的都不计入。每次试验至少15个平行处理，重复3次。

1.5 线虫后代数目测定

AA暴露对线虫生殖性能的影响，参照Lin的方法[23]，将15只同步化早期成虫分别单个移入Ф35 mm含0.0、0.001、0.01和0.1 mmol·L-1AA的NGM板中，1 d后将成虫移入新板，以保证不被后代线虫所混淆，直到线虫停止产卵，线虫在NGM板上所产虫卵经培养1 d后对孵化线虫进行计数，即为后代数量。

选取适宜的AA浓度，将单个早期成虫移入对应的NGM板中培养，测定g0代线虫后代数量，再从g0下一代中挑取早期成虫，测定g1代后代数量，g2和g3代后代数量测定方法同上，对照组在不添加AA的NGM板上测定。每次试验至少10个平行处理，重复3次。

1.6 摄食行为能力检测

AA暴露对线虫摄食行为能力的影响，参考Kohra的方法[24]。将同步化L1期的线虫分别加入到含有0.0、0.001、0.01和0.1 mmol·L-1AA的NGM板中，暴露培养48 h后，用KM培养液将线虫洗下，1 000 r·min-1离心1 min沉淀，移取约30只线虫在专用NGM培养皿上测试。所述测试培养皿如图1，Ф90 mm中下部设置一起始点，距起始点4 cm竖直方向上涂出半径为1 cm的一个菌落目标圈，并添加0.05 mol·L-1的NaN3，使得进入菌面采食的线虫麻醉不能爬出，移取的线虫添加到起始点，8 h后利用显微镜观察目标圈内的线虫数目。每次试验至少15个平行处理，重复3次。

捕食率=(接触目标圈的线虫数目/测试培养皿中线虫总数)×100%。

1.7 数据处理

实验数据用SPSS 16.0 软件ONEWAY-ANOVA进行分析，组间差异显著性采用Duncan法比较。结果以平均值±标准误表示，P<0.05为差异具有统计学意义。试验结果采用OriginPro 7.0画图。

图1 线虫采食能力测试培养皿示意图Fig. 1 The schematic of the nematode feeding ability test dish

2 结果(Results)

2.1 低剂量AA多世代持续暴露延长线虫的发育周期

不同浓度AA暴露对线虫发育周期的影响如图2(A)所示，随着AA浓度的增加，线虫发育周期呈现增加趋势，当AA浓度增加到1.0 mmol·L-1时，线虫的发育周期为(69.8±2.5) h，显著高于对照组的(63.8±1.8) h(P<0.05)，表明较高剂量的AA暴露能阻滞线虫的正常发育。为了研究低剂量AA多世代持续暴露对线虫发育周期的影响，选择了对g0代线虫发育没有影响的0.01 mmol·L-1AA对线虫连续暴露4代，结果如图2(B)，随着暴露世代的增加，线虫发育周期呈延缓趋势，而对照组没有明显变化。AA持续暴露至g2代时，线虫发育周期明显长于对照组(P<0.05)，表明低剂量AA对线虫发育阻滞作用能在世代间累积，多世代持续暴露可以诱发更大发育损伤。

图2 丙烯酰胺(AA)暴露对线虫发育周期的影响注：(A)不同浓度AA暴露对线虫发育周期的影响；(B)多世代AA暴露对线虫发育周期的影响；小写字母完全不同的表示差异显著，P<0.05，下同。Fig. 2 Effects of acrylamide (AA) on development period of the nematodeNote: (A) Effects on development period of the nematode with different concentration of AA; (B) Effects of multiple generations AA exposure on development period of the nematode; the different lowercase letters indicate a significant difference, P<0.05. The following is the same.

图3 AA暴露对线虫寿命的影响注：(A)不同浓度AA暴露对线虫寿命的影响；(B)多世代AA暴露对线虫寿命的影响。Fig. 3 Effects of AA on life span of the nematodeNote: (A) Effects on life span of the nematode with different concentration of AA; (B) Effects of multiple generations AA exposure on life span of the nematode.

2.2 低剂量AA多世代持续暴露缩短线虫寿命

不同浓度AA暴露对线虫寿命的影响如图3(A)显示，随着AA暴露浓度的增加，线虫寿命逐渐缩短，表明线虫受到的损伤逐步加剧。在0.0001 mmol·L-1浓度时，线虫平均寿命(21.6±1.1) d，与对照组(22.8±0.75) d差异不显著(P<0.05)，在0.001 mmol·L-1浓度时，线虫平均寿命已缩短至(18.1±1.1) d，显著低于对照组(P<0.05)。进一步选取对g0代线虫寿命没有影响的0.0001 mmol·L-1AA对线虫持续暴露4世代，研究多世代持续暴露对线虫寿命的影响，如图3(B)所示，0.0001 mmol·L-1AA条件下，连续暴露2代后，线虫寿命为(17.2±1.25) d，相比较对照组(21.6±1.5) d显著降低(P<0.05)。结果表明，AA对寿命的影响作用可以在世代间累积，随着暴露世代的增加，低浓度仍然可以诱发损伤，导致寿命缩短。

2.3 低剂量AA多世代持续暴露降低线虫后代数量

不同浓度AA对线虫生殖系统的损伤作用如图4(A)所示，随着AA浓度的增加，后代数量呈现减少趋势，当浓度增加至1.0 mmol·L-1时，线虫后代数量从对照组272±26降低到220±18，差异显著(P<0.05)。在AA多世代持续暴露试验中，我们选择了对g0后代数量没有影响的0.01 mmol·L-1AA对线虫持续暴露4世代，结果如图4(B)所示，线虫经0.01 mmol·L-1AA持续暴露2世代后，在g1代，平均后代数量由对照组268±22减少到218±20，差异显著(P<0.05)，表明低剂量AA多世代持续暴露可以诱导生殖损伤，导致后代数量减少。

图5 AA暴露对线虫摄食行为的影响注：(A)不同浓度AA暴露对线虫捕食行为的影响；(B)多世代AA暴露对线虫摄食行为的影响。Fig. 5 Effects of AA on feeding ability of the nematodeNote: (A) Effects on brood size of the nematode with different concentration of AA; (B) Effects of multiple generations AA exposure on feeding ability of the nematode.

2.4 低剂量AA多世代持续暴露对线虫摄食行为能力的影响

不同浓度AA对线虫捕食行为能力的影响如图5(A)所示，随着AA暴露浓度的增加，线虫捕食行为能力呈现退化趋势，在0.05 mmol·L-1浓度下，暴露8 h后，线虫对食物的摄食率从对照组68.8%±4.5%，降低到54.6%±2.0%，差异显著(P<0.05)。进一步选择对g0代摄食行为能力没有影响的0.005 mmol·L-1AA对线虫持续暴露4世代，结果如图5(B)所示，在持续暴露2世代后，g1代线虫捕食行为能力较对照组下降明显(P<0.05)。表明低剂量AA多世代持续暴露同样可以诱发线虫捕食行为能力的退化。

3 讨论(Discussion)

线虫发育周期、后代数量、寿命和摄食行为能力是AA慢性暴露毒性良好生物学终点。Jonker等[25]以生殖能力、发育周期、生殖期和体长为生物学终点，研究了重金属铜和镉离子急性暴露对线虫的生物学毒性。Anderson等[26]研究发现铅和铜暴露可以影响线虫食道球跳动频率，食道球跳动频率随着毒物浓度的增加而降低，并伴随线虫摄食率的减少。Li等[27]考察了10～500 mg·L-1AA暴露对线虫摄食行为能力的影响，发现摄食行为能力可以作为AA暴露损伤检测生物学终点。上述关于生殖能力、发育周期、生殖期、体长和摄食等生物学终点的应用多为10 mg·L-1浓度以上化学污染物的急性暴露实验，在低浓度慢性暴露上，Hasegawa等[28]研究了极低浓度AA慢性暴露对线虫寿命的影响，发现1 μg·L-1的浓度即可诱发线虫寿命的明显缩短。在本试验中，在0.001 mmol·L-1(约71 μg·L-1)浓度下AA可诱发寿命显著缩短，与Hasegawa报道的剂量的区别原因可能有2个方面，一是Hasegawa研究中线虫在幼虫L1期就开始染毒暴露，而本研究中在发育到早期成虫时才开始暴露，幼虫染毒可以诱发更大的危害；另一方面，尽管是相同品系，但是不同的饲养代数和饲养环境可以造成线虫生物学机能方面的差异。本试验中，首先研究了不同剂量(0.0001～1.0 mmol·L-1)AA对线虫的发育周期、后代数量、寿命和摄食行为能力的效应，显示AA暴露对线虫的损伤具有明显的剂量效应，而且，不同生物学终点对AA的敏感程度也有差异，0.001 mmol·L-1即可诱发寿命显著缩短，而对发育周期和后代数量产生显著影响的剂量为1.0 mmol·L-1，对摄食行为能力产生显著影响的剂量为0.05 mmol·L-1，以寿命最为敏感，捕食行为次之，发育和后代数量相当。对于多世代持续暴露试验，选取在当世代不能诱发显著损伤效应的AA浓度进行4世代暴露，0.0001 mmol·L-1的AA在第1代即可诱发衰老加速，0.01 mmol·L-1AA分别可在第1代和第2代诱发发育和繁殖的损伤，0.005 mmol·L-1AA可在第1代引起捕食行为的损伤，以寿命生物学终点最为敏感，摄食行为能力、发育和后代数量敏感程度依次降低，这一结果与当世代暴露结果相近。这些结果表明线虫发育周期、后代数量、寿命和摄食行为能力可以作为AA暴露毒性评价的生物学终点。

AA暴露生物学毒性在世代间具有累积作用。现有研究证实AA暴露可以诱发多种生物学毒性，Sarocka等[29]研究证实AA亚急性暴露可以抑制小鼠初级骨血管直径，造成小鼠骨骼组织发育损伤，Beland等[30]发现AA暴露可以诱发大鼠哈德氏腺和肺等多种组织肿瘤。Hasegawa等[28]报道AA可以诱发线虫寿命缩短、成虫体长缩短。Li等[27]报道AA可有诱发线虫食道球跳动频率降低，摄食率下降，其原因可能与AA诱发多巴胺神经元的功能退化有关。这些研究多是不同剂量水平对染毒生物当世代的损伤效应。本试验研究了低剂量化学污染物AA多世代持续暴露对线虫的生物学毒性，选取对于当世代线虫不能诱发生物学毒性的剂量，观察在多世代连续暴露4世代可能诱发显著的损伤，如0.005 mmol·L-1水平的AA对g0代线虫捕食行为没有影响，但持续暴露2世代后，在g1代即可诱发明显的损伤，与之相似还有0.01 mmol·L-1水平的AA对g0代线虫发育周期没有影响，持续暴露3世代后，在g2代可诱发发育周期明显延长，而对于寿命在0.0001 mmol·L-1暴露水平下，在持续暴露2世代后，在g1时代即检测到寿命明显的缩短，这些结果表明了AA生物学毒性在世代间逐步的积累，持续的多代低剂量暴露也一定程度上抑制了后代自身的回复作用，最终积累到一定程度形成明显的生物学损伤。另外，AA作为一种常见的食源性化学污染物，Walters等[12]和Tardiff等[31]通过对人均食物摄取AA估算每天AA摄入量，推测人体血液AA浓度达0.001 mmol·L-1，而本试验中0.001 mmol·L-1可诱发当代线虫寿命的损伤，0.0001 mmol·L-1持续暴露2世代就可诱发寿命的显著缩短，这一结果提示AA多世代持续的暴露生物学毒性值得更多关注。

总之，AA暴露会对线虫造成损伤，如影响正常发育、加速衰老、损伤行为能力、降低后代数量等，同时，本研究表明秀丽隐杆线虫可以作为一种较好的活体生物体系用来评估AA慢性多世代持续暴露的生物学损伤作用。