驴皮胶及鹿皮胶的化学品质分析与评价

张 磊，王燕华，刘 畅，宫瑞泽，李珊珊，孙印石*

（中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

驴皮胶（阿胶）作为我国传统中药，利用马科动物驴（Equus asinus L.）的皮经煎煮熬制、浓缩干燥而成的固体胶块[1]。驴皮胶的滋阴补血、提高免疫等功效已被现代研究所证实[2-5]。鹿皮胶是以鹿科动物梅花鹿（Cervus nipport T.）或马鹿（Cervus elaphus L.）的皮为原料经过蒸煮、浓缩、干燥而得，具有补血益气、补肾壮阳等功能[6-8]。研究发现驴皮胶及鹿皮胶中均含有大量蛋白质、氨基酸、脂类、糖类、核酸及微量元素等有效成分[9-10]，多种成分联合构成二者药理活性的物质基础。

现在对于驴皮胶的质量评价主要依据2015版《中华人民共和国药典》[1]，以水分、重金属、水不溶物及4 种氨基酸含量为评价标准。目前市场上以鹿胶糕及鹿胶粉为主的鹿皮胶系列产品已经上市，但其相应的评价标准还不完善。鉴于此，本研究根据《药典》[1]检测指标对东阿驴皮胶及自制鹿皮胶中水分、重金属、水不溶物及氨基酸含量进行测定与分析，同时还分别采用超高效液相色谱（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）及毛细管气相色谱法对两种胶类中核苷成分及脂肪酸含量与组成进行检测与比较分析，为胶类制品的质量评价提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

驴皮胶（批号：1510016、1606029、1608049）山东东阿阿胶股份有限公司；鹿皮胶（编号：160525、160701、170311） 自制。

硝酸、盐酸、硼氢化钾、氢氧化钾（均为优级纯）北京化学试剂研究所；超纯水（电阻率≥18.2 Ω），Cu、Cd、Pb、As、Hg的单元素标准储备液（质量浓度均为1 000 μg/mL） 国家标准物质研究中心；H型氨基酸混合标准溶液 日本Wako公司；核苷对照品：尿嘧啶（LOT：TM0313XB13）、胞嘧啶（LOT：TN1128XA13）、腺嘌呤（LOT：X18N6M6005）、鸟嘌呤（LOT：KM0522CA14）、次黄嘌呤（LOT：TM0313XC13）、黄嘌呤（LOT：AJ0722MA14）、尿苷（LOT：TM0313XA13）、胸腺嘧啶（LOT：140708-200401）、肌苷（LOT：TJ0623XA13）、鸟苷（LOT：AJ0609NA14）、腺苷（LOT：KM0529CA14）、2’-脱氧鸟苷（LOT：N07A7W12580）、β-胸苷（LOT：DN1122WB13）（纯度≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；37 种脂肪酸甲酯混合标准品（10 mg/mL）上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇、乙腈、正己烷（均为色谱纯） 美国Fisher公司；三氯甲烷、冰乙酸（均为分析纯） 北京翰天科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A型气相色谱仪 美国Agilent公司；ACQUITY UPLC H-Class UPLC仪 美国Waters公司；MS-204S型精密电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；DHS16-A多功能红外水分测定仪 上海精密科学仪器有限公司；MSW-4微波消解仪 德国Berghof公司；NexION 350X电感耦合等离子体质谱仪 美国Perkin Elmer公司；ZEEnit700原子吸收光谱仪 德国Jena公司；PF6-3原子荧光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；WP-UP-WF-40微量分析型超纯水机 四川沃特尔水处理设备有限公司；JP-100ST超声波清洗机深圳洁盟清洗设备有限公司；L-8900型氨基酸自动分析仪日本日立公司；SF-TGL-16M台式离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司；EX125DZH电子天平 奥豪斯仪器有限公司；多样品平行蒸发仪 瑞士Büchi公司；HGC-36A干式氮吹仪 天津恒奥科技发展有限公司；DB-23气相毛细管色谱柱 美国Superco公司。

1.3 方法

1.3.1 鹿皮胶的制作

称取适量新鲜鹿皮，经清洗、浸泡、熬汁、除杂、过滤、凝胶、干燥、整形而制得鹿皮胶。

1.3.2 水分含量测定

称取驴皮胶（鹿皮胶）粉末样品5 g，平铺于水分测定仪的秤盘上，设置温度100 ℃，时间20 min，待加热停止，读数，每个样品重复3 次。

1.3.3 重金属元素含量测定

1.3.3.1 标准曲线绘制

将Pb、Cd、As、Hg、Cu标准溶液稀释至10 μg/L，置于100 mL容量瓶，2% HNO3溶液定容，摇匀，备用，上机自动质量浓度梯度稀释绘制标准曲线。各元素线性回归方程见表1。

表1 元素线性回归方程Table 1 Linear regression equations for heavy metal elements

1.3.3.2 样品制备

精密称取驴皮胶（鹿皮胶）粉末样品0.30 g，置于消解罐中，加入5 mL浓HNO3，参照文献[11]设定消解程序，进行微波消解，将消解液转移至100 mL容量瓶，超纯水洗涤并定容，摇匀，备用。以同法制备空白溶液。

1.3.3.3 样品测定

利用质谱调谐液调谐仪器，参照文献[11]设置仪器工作参数，依次测试标准液及样品溶液。

1.3.4 水不溶物的测定

精密称取驴皮胶（鹿皮胶）粉末样品1.00 g，置于10 mL具塞离心管中，加水5 mL，加热溶解，以5 mL温水洗涤3 次，洗液并入离心管中，将离心管置于40 ℃水浴保温15 min，室温2 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入5 mL温水洗涤3 次，弃上清液，离心管于105 ℃加热2 h，取出冷却30 min，精密称定。

1.3.5 氨基酸含量的测定

1.3.5.1 标准曲线绘制

将氨基酸标准混合液用0.1 mol/L HCl溶液稀释1 000 倍，取适量注入氨基酸自动分析仪测试。

1.3.5.2 样品前处理

精密称取驴皮胶（鹿皮胶）粉末样品0.10 g置于50 mL氨基酸水解管中，加入6 mol/L的盐酸溶液20 mL，超声10 min，充氮，密封，置于110 ℃恒温干燥箱中水解22 h，结束后取出冷却至室温，定容，取800 μL置于10 mL试管中，于70 ℃真空干燥箱中烘干，加入0.02 mol/L的盐酸溶液2 mL，涡旋混匀，过0.22 μm孔径水系微孔滤膜后上机待测。

1.3.5.3 样品测定

取氨基酸标准混合液与制备好的样品各20 μL注入氨基酸自动分析仪进行测定。采用茚三酮进行柱后衍生，色谱条件：HITACHI 2622SC-PH离子分离柱（4.6 mm×60 mm），日立专用3 μm磺酸型阳离子交换树脂，柱温57 ℃，反应单元温度135 ℃；泵1流速0.4 mL/min，泵压力0.3～25 MPa，泵2流速0.35 mL/min，泵压力0～0.2 MPa；检测波长：1通道570 nm，2通道440 nm；进样体积20 μL；分析时间：1通道32 min，2通道10 min。

1.3.6 核苷含量的测定

1.3.6.1 标准溶液配制

精密称取胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、肌苷、鸟苷、腺苷、2’-脱氧鸟苷、β-胸苷13 种对照品各5 mg，分别置于10 mL容量瓶，鸟嘌呤、黄嘌呤加0.1%氢氧化钾溶液，其他对照品加水定容。取各标准品溶液2 mL于50 mL容量瓶，配制成混合标准品母液。分别取混合标准品母液1、2、3、4、5、6、8 mL于10 mL容量瓶，定容，配制成2、4、6、8、10、12、16 μg/mL的对照品溶液。

1.3.6.2 样品制备

精密称取驴皮胶（鹿皮胶）粉末样品0.10 g，置于4 mL离心管中，加入3 mL蒸馏水，称量，室温下超声提取60 min，冷却至室温，称量，加水补足损失的质量，混匀并于13 000 r/min离心10 min，取上清液以0.22 μm滤膜滤过，即为待测品。

1.3.6.3 色谱条件

色谱柱：A C Q U I T Y U P L C®H S S T 3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，0.01%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0～1 min，0% A；1～8 min，0%～8% A；8～9 min，8%～15% A；9～10.5 min，15% A；10.5～11 min，15%～0% A；11～15 min，0% A；流速：0.4 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：260 nm；进样量：3 μL。

1.3.6.4 样品测定

分别吸取对照标准品与待测样品各3 μL注入UPLC仪测定，每份样品平行测定3 次，取平均值，获得13 种对照标准品的色谱峰峰面积，以外标法计算供试样品中核苷类成分含量。

1.3.7 脂肪酸含量的测定

1.3.7.1 标准溶液配制

准确称取脂肪酸甲酯混合标准品200 μL置于样品瓶中，加入正己烷定容至1 mL，上机备用。

1.3.7.2 样品甲酯化

精密称取驴皮胶（鹿皮胶）粉末样品1.00 g，置于50 mL具塞水解管中，加入10 mL 1%的氢氧化钾-甲醇溶液，振荡混匀后于室温下静置1 h，依次加入0.5～1 mL 10%乙酸溶液及5 mL正己烷，摇匀后静置分层过夜，将上层有机相转移至新试管，以氮气吹干，加入正己烷定容至2 mL，以0.22 μm滤膜过滤后供气相色谱分析。

1.3.7.3 色谱条件

色谱柱：DB-23毛细管气相色谱柱（100 m×0.25 mm，0.15 μm）；载气：高纯氮气，流速：0.5 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；分流比：40∶1；程序升温：初始温度50 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升温到175 ℃后以3 ℃/min升温到230 ℃，保持8 min；检测器：氢火焰离子化检测器；检测器温度：280 ℃。

1.3.7.4 样品测定

分别吸取对照标准品与待测样品各1 μL注入气相色谱仪测定，每份样品平行测定3 次，取平均值。采用保留时间对比法对脂肪酸混合标准品进行定性分析，待测样品谱图与标准谱图相似度不小于95%时确定为该种化合物。脂肪酸定量分析采用面积归一法，根据峰面积计算各种脂肪酸的相对含量。

1.4 数据处理

所有数据采用GraphPad Prism 6软件处理，应用独立t检验对数据进行显著性分析。所有数据以表示。

2 结果与分析

2.1 水分含量结果

经测定，驴皮胶与鹿皮胶在100 ℃、加热20 min时的水分质量分数分别为12.77%及14.22%，鹿皮胶中水分含量略高于驴皮胶（P＜0.05）。

2.2 重金属元素含量结果

表2 驴皮胶及鹿皮胶中重金属含量Table 2 Heavy metal contents in donkey hide gelatin and deer skin gelatin mg/kg

如表2可知，驴皮胶及鹿皮胶中的重金属元素含量普遍很低，其中Pb含量较高，在二者中的含量分别达到1.01、1.33 mg/kg；Cu含量也相对较高（0.8 mg/kg），其他重金属元素含量较低，均未大于0.1 mg/kg。

2.3 水不溶物含量

经测定计算，驴皮胶及鹿皮胶中的水不溶物质量分数分别为（1.80±0.25）%及（1.60±0.80）%，二者差异不显著（P＞0.05）。

2.4 氨基酸含量测定结果

表3 驴皮胶与鹿皮胶中氨基酸成分含量及相对含量Table 3 Amino acid compositions of donkey hide gelatin and deer skin gelatin

氨基酸种类及含量是评定蛋白质营养价值的重要指标[12]。本研究中，驴皮胶与鹿皮胶中氨基酸质量分数分别为85.66%及90.02%（表3），鹿皮胶中氨基酸总量略高于驴皮胶（P＜0.05）；所有氨基酸组分中，以甘氨酸（Gly）含量最高，其在两种胶中质量分数均达到21.00%以上，占氨基酸总含量的25%，Gly已被证明可在氧化应激[13]、细胞损伤[14]及药物中毒[15]方面均有保护作用，近年来的研究发现Gly还具有抗炎及免疫调节作用[16]；所有氨基酸中含量最低的为半胱氨酸（Cys），其质量分数只有0.10%，占氨基酸总含量的0.13%；鹿皮胶中精氨酸（Arg）及脯氨酸（Pro）含量极显著高于驴皮胶中的含量（P＜0.01）；驴皮胶中Val的含量极显著高于鹿皮胶（P＜0.01）。驴皮胶与鹿皮胶中必需氨基酸质量分数分别为16.14%及15.89%。此外，Glu、Ala、Pro在两种胶中的相对含量均超过10%。Glu是脑中含量最多的氨基酸，作为神经递质参与学习及睡眠等行为[17]；Ala可参与葡萄糖诱导的动物体内胰岛素分泌的生理调节[18]；Pro被报道与组织生长、机体免疫及体内多胺合成密切相关[19]。综上可见，驴皮胶及鹿皮胶可利用氨基酸开发营养调节剂。

2.5 核苷含量测定结果

表4 驴皮胶与鹿皮胶中核苷成分含量及百分比Table 4 Nucleosides compositions of donkey hide gelatin and deer skin gelatin

核苷参与细胞信号转导及生物酶的调控等生物反应，核苷及其衍生物具有多种生物活性[20]，常被用于药物开发。驴皮胶与鹿皮胶核苷成分含量测定结果见表4。驴皮胶中总核苷含量达到191.42 μg/g，各成分的含量分布在0.93～35.46 μg/g之间，含量最高的核苷为黄嘌呤，含量占总核苷含量的18.52%；含量最低的为肌苷，只占0.49%；鹿皮胶中总核苷含量达到284.69 μg/g，各成分的含量分布在0.28～70.44 μg/g之间，含量最高的核苷为次黄嘌呤，含量达到总含量的24.68%；含量最低的为2’-脱氧鸟苷，只占0.10%。驴皮胶中的腺嘌呤、β-胸苷、鸟苷及尿苷含量均高于鹿皮胶中的含量（P＜0.001）；而鹿皮胶中的尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、胸腺嘧啶及核苷总含量均高于驴皮胶中的含量（P＜0.001）。研究发现，次黄嘌呤作为重要的生物碱嘌呤，对心血管疾病作用显著[21]；此外，次黄嘌呤及黄嘌呤均被证实具有舒张气管、平喘等药理作用[22]，尿嘧啶可抑制5-氟尿嘧啶的分解，后者在抗癌抗肿瘤方面应用广泛[23]。本研究发现鹿皮胶中尿嘧啶、次黄嘌呤及黄嘌呤含量均较高且高度显著高于驴皮胶中含量，说明鹿皮胶具有可以用于开发此类药物的前景。在鹿皮胶中未检测到胞嘧啶、肌苷及β-胸苷3 种成分，可能是由于鹿体内特殊代谢或原料加工过程中损失所致，还有待于更进一步的研究。

2.6 脂肪酸的含量测定

2.6.1 脂肪酸含量及组成

由表5可知，驴皮胶中共含有21 种脂肪酸，其中饱和脂肪酸9 种，占总脂肪酸含量的26.52%；单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸各含6 种，分别占总脂肪酸含量的33.36%及40.14%；鹿皮胶中脂肪酸共含有22 种，其中饱和脂肪酸9 种，占总脂肪酸含量的36.29%；单不饱和脂肪酸6 种及多不饱和脂肪酸7 种，分别占总脂肪酸含量的38.64%及25.08%。

表5 驴皮胶与鹿皮胶中脂肪酸含量及百分比Table 5 Fatty acids compositions of donkey hide gelatin and deer skin gelatin

续表5

2.6.2 饱和脂肪酸比较

由表5可知，在饱和脂肪酸中，棕榈酸（C16:0）含量最高，其在驴皮胶及鹿皮胶中的占比分别达到19.03%及24.64%，鹿皮胶中的含量显著高于驴皮胶（P＜0.05）；月桂酸（C12:0）含量最低，其在两种胶中均只占0.10%左右（表5）。鹿皮胶中的肉豆蔻酸（C14:0）及十五碳酸（C15:0）的含量均极显著高于驴皮胶（P＜0.01）；鹿皮胶中硬脂酸（C18:0）含量略高于驴皮胶，但差异不显著（P＞0.05）（图1）。动物类油脂中的饱和脂肪酸主要以棕榈酸及硬脂酸为主，二者均能降低血清中胆固醇的含量[24]。本研究发现鹿皮胶中棕榈酸及硬脂酸的含量均高于驴皮胶，说明鹿皮胶具备更好的防治高胆固醇血症的作用。

2.6.3 不饱和脂肪酸比较

单不饱和脂肪酸中以油酸（C18:1,cis-9）含量最高，其在驴皮胶及鹿皮胶中的占比分别达到28.01%及20.68%；顺-10-十七碳烯酸（C17:1,cis-10）及顺-11-二十碳烯酸（C20:1,cis-11）含量最低，它们在两种胶中的占比只有0.3%左右（表5）。鹿皮胶中顺-9-肉豆蔻烯酸（C14:1,cis-9）及棕榈油酸（C16:1,cis-9）的含量均高度显著高于驴皮胶（P＜0.001）（图1）。

多不饱和脂肪酸中含量最高的是亚油酸（C18:2,cis-9,12），驴皮胶中的占比达到31.59%，显著高于鹿皮胶中的21.21%（P＜0.05）；顺-11,14-二十碳二烯酸（C20:2,cis-11,14）含量最低，其在两种胶中占比只有0.20%左右；花生四烯酸（C20:4,cis-5,8,11,14）只在鹿皮胶中检测到，其占比达到0.21%；证明驴皮胶中并不含有花生四烯酸，这与胡晶红等[25]的研究结果相一致；驴皮胶中α-亚麻酸（C18:3,cis-9,12,15）的含量也相对较高，明显高于鹿皮胶（P＜0.01）（图1）。

图1 驴皮胶与鹿皮胶中主要单一脂肪酸含量比较（相对含量≥1%）Fig. 1 Comparison of mono fatty acid contents in donkey hide gelatin and deer skin gelatin

2.6.4 各类脂肪酸总量比较

图2 驴皮胶与鹿皮胶中脂肪酸总量比较Fig. 2 Comparison of total fatty acid contents in donkey hide gelatin and deer skin gelatin

由图2可知，鹿皮胶中总脂肪酸含量（（12 895.50±1 167.12）mg/kg）高于驴皮胶中的含量（（11 695.83±1 607.74）mg/kg），但差异并不显著（P＞0.05）；鹿皮胶中的饱和脂肪酸含量（（4 690.38±490.53）mg/kg）及单不饱和脂肪酸含量（（5 039.13±526.02）mg/kg）均高于驴皮胶，而驴皮胶中多不饱和脂肪酸含量（（4 717.95±651.93）mg/kg）、必需脂肪酸及n-6型不饱和脂肪酸含量均显著高于鹿皮胶（P＜0.05），而n-3型不饱和脂肪酸含量极显著高于鹿皮胶（P＜0.01）。

人体内必需脂肪酸包括亚油酸及α-亚麻酸，二者不能由人体自身合成，必需从食物中获得[26]。本研究中发现驴皮胶中的必需脂肪酸明显高于鹿皮胶，且亚油酸及α-亚麻酸含量均高于鹿皮胶，证明驴皮胶中必需脂肪酸的比例更有助于营养平衡。

食品中的脂肪酸比例组成对于人体健康至关重要，关于饱和脂肪酸/单不饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸的比例，不同国家的推荐比例通常为1∶1∶1、1∶1.5∶1、1∶4∶1及3∶4∶3等[27-28]，中国营养学会推荐比例为1∶1∶1[29]。本研究中发现驴皮胶中饱和脂肪酸/单不饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸的比例为1∶1.2∶1.5，鹿皮胶中三者的比例为1.5∶1.6∶1，二者的比例均接近于推荐的健康比例。

n-6及n-3型多不饱和脂肪酸的含量及组成对于人体健康具有重要影响[30]，高比例的n-6/n-3可以导致冠心病、癌症、炎症及自身免疫缺陷等多种疾病的发生[31-34]。世界卫生组织推荐n-6/n-3的比例为6∶1[35]，中国营养学会推荐二者比例为4∶1～6∶1[29]。本研究结果表明，驴皮胶中n-6/n-3的比例为5.26∶1，而鹿皮胶中n-6/n-3的比例达到9.55∶1，可见驴皮胶中不饱和脂肪酸的组成比例更接近于营养学会推荐比例。

3 结 论

本研究中检测所得驴皮胶及鹿皮胶中水分、重金属、水不溶物及氨基酸含量均达到《药典》[1]规定水平，证明鹿皮胶同驴皮胶一样具有产品深加工的潜力。驴皮胶及鹿皮胶均含有较多的Gly、Glu、Ala、Pro，对于调控人体内多种生理功能方面发挥重要作用。鹿皮胶中具有药理功能的有益核苷较多，可进一步研究其有效成分为新药开发提供依据。鹿皮胶在有益饱和脂肪酸含量方面优于驴皮胶，而后者在必需脂肪酸及多不饱和脂肪酸含量及组成方面更有优势，二者在饱和脂肪酸/单不饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸的比例上均接近于推荐的健康比例。