米糠蛋白的起泡特性及其泡沫微观形态

张曼君，李小敏，张燕鹏,*，齐玉堂，张维农，胥 伟

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.大宗粮油精深加工教育部重点实验室，湖北 武汉 430023）

米糠作为水稻加工过程中的主要副产物，含有丰富的膳食纤维、功能性油脂、蛋白质、维生素及矿物质等营养成分，是一种极具开发潜力的高附加值资源[1]。米糠蛋白在米糠中的质量分数为12%～16%，具有良好的营养价值，其必需氨基酸组成齐全，氨基酸配比合理平衡，接近于联合国粮农组织/世界卫生组织推荐模式，并且具有消化率高和低过敏性的优点[2-3]。因此米糠蛋白是一种高品质的植物蛋白质资源，特别适合被开发应用于婴幼儿和特殊人群营养配方食品中[4]。

米糠蛋白具有良好的功能特性，研究发现其起泡特性与蛋清蛋白相近[5]，因此可被当作发泡剂而应用于泡沫类型食品的加工中，如搅打奶油、充气糖果、慕斯、奶昔、冰淇淋、蛋糕、面包、发泡酸乳饮料等，从而利用形成的微细泡沫赋予食品体系良好的质构特征与口感，使食品具有质地均匀细腻、润滑的良好品质[6-7]。已有研究表明，蛋白质的起泡特性不仅取决于本身的结构特征，界面性质、两亲电荷分布及表面疏水性等物化性质[8]，同时也受体系pH值、离子强度以及其他蛋白质竞争性吸附等因素的影响[9]。

目前鲜见有关对米糠蛋白起泡特性的系统研究，因此通过研究分析不同pH值和NaCl浓度体系下米糠蛋白的起泡特性和气泡的微观形态并阐述二者之间的相互关系，对促进米糠蛋白起泡特性的基础理论研究和构建具有不同质构的米糠蛋白泡沫类食品体系具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米糠蛋白（蛋白质质量分数84.9%）由实验室自制；罗丹明B 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；盐酸、氢氧化钠、氯化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SorvallRC6Plus型高速冷冻离心机 美国Thermo Scientific公司；FiveEasy实验pH计 瑞士Mettle Toledo公司；Alpha 1-2 LD plus冷冻干燥机 德国Christ公司；KND-103F自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司；手持式30631型电动打蛋器 日本ECHO公司；FV1200激光共聚焦显微镜 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白制备

取新鲜米糠用高速粉碎机粉碎后过60 目筛，按料液比1∶5（g/mL）与正己烷混合后在55 ℃条件下反复萃取5 次（残油含量小于1%）后可获得脱脂米糠粉。取脱脂米糠粉以料液比1∶10（g/mL）与蒸馏水混合，用2 mol/L NaOH溶液调节pH值为9.0，在55 ℃条件下搅拌浸提2 h后，25 ℃、10 000 r/min离心15 min获得上清液。用2 mol/L HCl溶液调节上清液的pH值至4.5并静置2 h，然后20 ℃、8 000 r/min 离心15 min弃去上清液得到蛋白质沉淀。蛋白质用去离子水洗涤3 次后搅拌并调节pH值为7.0进行复溶，经冷冻干燥后制得米糠蛋白并于4 ℃冰箱保存备用。取部分米糠蛋白样品使用mico-Kjeldahl法测定蛋白质含量。

1.3.2 米糠蛋白起泡特性测定

参考Zou Yuan[10]和Dhayal[11]等的方法，并作一定修改。考察pH值、NaCl质量分数、pH-NaCl组合条件下对米糠蛋白起泡特性的影响。

pH值：将蛋白质以5 mg/mL的质量浓度分散于蒸馏水中，调节pH值分别为2、4、6、7、8、10、12，然后取30 mL蛋白质溶液于特制带刻度的试管（直径4 cm，高10 cm）中，将电动打蛋器深入到溶液中约1 cm处，搅拌15 s后，立即测量泡沫体积V0，静置2 h后再次测定体积Vt。按公式（1）和（2）计算蛋白质的起泡能力及泡沫稳定性：

NaCl质量分数：将蛋白质以5 mg/mL的质量浓度分散于蒸馏水中，调节pH值为7，添加质量分数分别为0%、0.25%、0.5%、1%、2% NaCl，然后起泡并按公式（1）和（2）计算起泡能力及泡沫稳定性。

pH-NaCl组合：根据对单因素条件下起泡能力及泡沫稳定性的分析，选取不同pH值、NaCl组合测定起泡特性。将蛋白质以5 mg/mL分散于蒸馏水中，调节pH值分别为2、4、7、12，再添加质量分数分别为0%、0.25%、1% NaCl，然后起泡并按公式（1）和（2）计算起泡能力及泡沫稳定性。

1.3.3 泡沫微观形态分析

参考Sadahira[12]和Yang Xin[13]等的方法并稍作修改。取29.5 mL配制好的蛋白质溶液，添加0.5 mL罗丹明B染液（1 mg/mL）使蛋白质溶液质量浓度为5 mg/mL，采用1.3.2节方法进行起泡实验，起泡结束后立刻取样于凹型载玻片，盖上载玻片后在Olympus激光共聚焦显微镜观察泡沫的微观形态并进行分析。激发波长为543 nm，放大倍数为100 倍。

1.4 数据处理与分析

实验均重复3 次后求平均值，采用Origin 8.5和SPSS分析软件对实验数据进行处理分析；通过采用Image Pro Plus图片分析软件对激光共聚焦图片进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 pH值对米糠蛋白起泡特性的影响

如图1所示，当pH值为4时，米糠蛋白溶液的起泡能力最差（20±0）%，但具有较好的泡沫稳定性（88.3±7.3）%，这可能是因为在等电点附近时蛋白质的溶解性较低，可溶性蛋白减少[14]，沉降蛋白质较多，从而没有足够的蛋白质吸附到界面[15]，使起泡能力降低。同时在等电点附近由于缺乏相互排斥作用，这有利于气-液界面上蛋白质之间的相互作用[16]，形成多层蛋白分子网络结构而增加界面膜的黏度[17-18]，从而有利于泡沫稳定性的提高。当pH值偏离米糠蛋白的等电点时，起泡能力会增加而泡沫稳定性有所下降，尤其当溶液的pH值为12时起泡能力增加最为显著。这是因为当溶液的pH值偏离等电点时，蛋白质分子内的可解离基团发生解离，增加蛋白质所带净电荷量，导致分子间和分子内的静电排斥力增加，削弱了分子内的疏水相互作用[19-20]，使得蛋白质分子膨胀展开，柔性增加，从而有利于更快地吸附至界面而增强起泡能力[21-22]，但此时蛋白质分子在界面由于静电力的排斥相互作用，而使米糠蛋白无法形成较为紧密的界面膜，降低界面膜的黏弹性和机械性能而使泡沫稳定性变差[23-24]。

图1 pH值对米糠蛋白起泡特性的影响Fig. 1 Effect of pH on foaming properties of rice bran protein

2.2 NaCl质量分数对米糠蛋白起泡特性的影响

图2 NaCl质量分数对米糠蛋白起泡特性的影响Fig. 2 Effect of NaCl concentration on foaming properties of rice bran protein

如图2所示，NaCl质量分数的增加有利于提高米糠蛋白的起泡能力和泡沫稳定性，特别是当pH 7、NaCl质量分数为1%时米糠蛋白的起泡能力与泡沫稳定性均可达到较大值，分别为（90.0±5.8）%和（84.6±0）%，这表明此时米糠蛋白的分子结构与理化特性保持了较好的平衡状态，以保证可同时具有较好的起泡能力和泡沫稳定性。已有研究发现，NaCl可通过非特异性的静电作用与蛋白质分子发生相互作用而改变其所带净电荷量，并影响蛋白质分子的展开和聚集状态及水合作用[25]。因此当离子浓度较低时，由于“盐溶”效应使蛋白质的溶解度增加从而使起泡能力提高[26]；当离子浓度过高时，会影响蛋白质分子的水合作用而可能使部分蛋白质分子发生聚集，从而使起泡能力有所降低[27]。同时由于盐离子对蛋白质分子电荷的中和作用，有利于加速蛋白质分子在膜界面的吸附及扩散[28]，并使其在界面的静电排斥作用减弱，分子间的相互作用增强而易于形成黏弹性和机械性质较好的界面膜，从而有利于泡沫稳定性的增强[29]。

2.3 pH-NaCl组合条件下米糠蛋白的起泡特性

图3 pH-NaCl组合对米糠蛋白起泡能力（A）和泡沫稳定性（B）的影响Fig. 3 Effect of pH and NaCl combinations on foaming capacity (A)and foam stability (B) of rice bran protein

由图3A可知，在不同pH值条件下添加NaCl后均对米糠蛋白的起泡能力有所改善，其中当pH值分别为2、4、7时米糠蛋白的起泡能力随着NaCl质量分数的增加而升高，并且当NaCl添加量为1%时，起泡能力改善最为显著；而在pH值为12，NaCl质量分数为0.25%时米糠蛋白的起泡性达到最大值（196.7±5.8）%。如图3B所示，只有当米糠蛋白溶液的pH值为7时，添加NaCl可提高米糠蛋白的泡沫稳定性，而当pH值为2、4和12时，NaCl的添加泡沫稳定性无显著改善，甚至会降低米糠蛋白的泡沫稳定性，这也说明与NaCl相比，pH值对米糠蛋白泡沫稳定性的改善更为显著。

2.4 泡沫微观形态分析

通过采用激光共聚焦显微镜观察分析气泡的大小与数量等几何动态变化特性，可一定程度上从微观的角度反映米糠蛋白的起泡特性[13,30]，因此根据上述实验结果，选取pH值分别为2、4、7、12与NaCl质量分数分别为0%和1%的组合条件下的米糠蛋白泡沫进行微观形态的观察。

图4 激光共聚焦显微扫描图片Fig. 4 Confocal laser scanning microscope (CLSM) images

如图4所示，随着时间的延长，气泡的数量由于空气的扩散沥水、凝集及歧化等反应而减少[31]，进一步对起泡初始阶段的气泡直径分布频率直方图（图5）分析可知，在不添加NaCl的情况下，与其他pH值相比，米糠蛋白溶液的pH值为4时气泡直径的分布范围较窄也较为均匀，因此可以避免由于小气泡中的气压小于大气泡而发生歧化反应，这在一定程度上有利于泡沫的稳定性[12]；相比当米糠蛋白溶液pH值为2时，因所形成的泡沫中含有较多直径较大的气泡，则易发生歧化反应，因此泡沫稳定性较差（图1）[13,30]。另外由图4可知，当pH值为4时，米糠蛋白在连续相中的分布并不均匀，倾向于在气泡表面聚集，这就易于形成较为黏稠的界面膜，从而有利于泡沫的稳定性[23]。当米糠蛋白溶液中添加一定量的NaCl时，由图5可知，在pH值为2的情况下，起始阶段气泡的平均直径（d32）显著减小，但随着时间的延长气泡发生了明显的歧化和凝聚反应，这说明NaCl的添加可能屏蔽了蛋白质表面部分正电荷而有利于加速米糠蛋白在气-液界面的吸附和扩散以改善起泡能力[9]，但并不利于泡沫稳定性。在其他pH值条件下添加NaCl后气泡平均直径（d32）则均有一定程度的升高。

图5 CLSM图片初始时刻（0 min）气泡直径分布频率直方图Fig. 5 Histograms of distribution frequency of bubble diameter in CLSM images (0 min)

为了进一步说明不同反应体系下米糠蛋白起泡特性和气泡的微观形态，对气泡的平均面积与数量随时间的变化规律进行分析，如图6所示。与未添加NaCl的米糠蛋白溶液相比，添加NaCl后当pH值为2和4时，初始阶段气泡平均面积相差不大，但气泡的数量增加明显；而当pH值为7和12时，初始阶段气泡数量相差不大，但气泡的平均面积增加，因此这二者的综合效应从宏观上表现为NaCl的添加可改善米糠蛋白的起泡能力（图3A）。另外结合气泡数量的变化速率分析可知，在30 min内，在pH 2、4和12条件下添加NaCl后米糠蛋白的起泡数量减少的速率明显增加，这表明NaCl的加入对泡沫的稳定性没有明显改善作用（图4），而对于在pH值为7的情况下，添加NaCl后在前10 min内气泡数量降低的速率较高，然后速率有所降低，同时30 min后与未添加NaCl的米糠蛋白溶液相比，气泡的平均面积较大，因此虽然气泡的数量较少，但在宏观形态上与对照样品相比，泡沫体积的稳定性并未降低（起泡30 min后二者的泡沫稳定性分别为pH 7、0% NaCl：（89.4±4.1）%和pH 7、1% NaCl：（91.7±1.8）%）。因此基于对米糠蛋白泡沫的微观形态的动态分析说明，在利用蛋白质泡沫改善食品品质时一方面要考虑泡沫的稳定性，同时也要考虑到气泡的微观形态，以便制备出具有符合最佳感官体验的产品[32]。

图6 气泡平均面积和气泡数量随观察时间变化Fig. 6 Changes in mean bubble area and bubble count per area in CLSM images from 0 to 30 min

3 结 论

通过单因素试验分析pH值和NaCl质量分数对米糠蛋白起泡特性的影响。研究发现当pH值为4时，米糠蛋白的泡沫稳定性可达最大值（88.3±7.3）%，而当溶液pH值偏离4时，泡沫稳定性降低但起泡能力增加，在pH 2和12条件下起泡能力可分别提高至（98.3±4.4）%和（168.9±10.2）%。另外在pH 7条件下添加1%的NaCl后，米糠蛋白的起泡能力和泡沫稳定性可分别提高至（90.0±5.8）%和（84.6±0）%。

在单因素试验的基础研究不同pH值和NaCl质量分数组合条件下米糠蛋白起泡特性。研究结果表明，在pH 2、4、7和12条件下，添加NaCl均可显著提高米糠蛋白溶液的起泡能力，但仅在pH值为7的情况下添加NaCl可改善泡沫稳定性。

通过对不同环境因素条件下米糠蛋白泡沫微观形态进行分析发现，起始阶段泡沫直径的大小和分布均可影响泡沫体系的歧化反应进而影响米糠蛋白溶液的起泡能力与泡沫稳定性；另外通过对气泡平均面积与数量随时间的变化规律分析可知，米糠蛋白溶液的宏观泡沫稳定性与二者的综合效应有关。因此在实际应用中可通过对环境因素的调控来控制起泡的微观形态以满足产品的品质要求。