短期香烟烟雾及脂多糖气道刺激对小鼠气道免疫细胞的影响①

陈瑞凤 梁紫尧 于旭华 尹硕淼 范 龙 林 琳 许银姬 陈云波 王 奇

(广州中医药大学，广州510405)

香烟烟雾与脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作为气道炎症刺激物，常用于慢性阻塞性肺病的动物模型的建立。尽管气道炎症的主要表现之一气道免疫炎症细胞的浸润，然而国内的多数体内实验研究着眼于香烟及脂多糖对气道上皮细胞或肺组织的损伤作用[1]，而疏于对气道免疫细胞的募集及功能的报道。本研究通过运用香烟烟雾短期(4 d)刺激及LPS气道滴注诱发气道免疫反应，报道熏烟及LPS对气道免疫细胞分类计数、免疫细胞形态、免疫细胞应激能力以及气道组织对免疫细胞趋化成熟作用的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 脂多糖(Sigma 公司，055：B5，批号:L2880)。NucleoZOL(MNG；货号740404.2)。异丙醇(广州化学试剂有限公司)。SYBR Premix Ex TapTMⅡ试剂盒(TaKaRa；货号RR820A)。PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒(TaKaRa；货号RR036A)。PDB(2-丁酸佛波醇酯；Sigma aldrich，货号：P1269)和L-012(8-氨基-5-氯-7-苯基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4-二酮；Wako Pure Chemical Industries，货号：120-04891)。大前门牌过滤嘴香烟(烟碱含量0.8 mg，焦油量11 mg/支，上海烟草集团)。引物均来源于Invitrogen(Fisher Scientific公司)，CXCL-15：上游引物TCAATTCCCACCTT-GAGGCA，下游引物CCAGAATCAACGCAAAGCCA；GM-CSF：上游引物TCAAAGAAGCCCTGAACCTCC，下游引物GTGTTTCACAGTCCGTTTCCG；β-Actin：上游引物GCTCCTAGCACCATGAAGATCA，下游引物AGGGTGTAAAACGCAGCTCA。

1.1.2仪器 多功能台式冷冻离心机(Allegra X-22R)，生物样品均质器(Bertin technologies)，UV-7504型单光束紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)，PCR扩增仪(Applied Biosystem)，荧光定量PCR仪(ViiA7)，Countstar自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)，多功能酶标仪(Infinite M1000 PRO)，自动液基薄层细胞制片机(HQTCT-Thin PlusⅠ)。

1.1.3实验动物 SPF级6～8周龄BALB/c小鼠，雌性，体重(20±2)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：11400700173607。饲养温度：(24±3)℃，相对湿度：(40±5)%，光照：明暗交替，噪声<55 dB，自由摄水摄食，每周更换垫料2次。

1.2方法

1.2.1动物的分组及造模 动物分组：小鼠随机分为3组，对照组、LPS滴注组和熏烟组，每组动物8～10只。

干预措施：熏烟组：小鼠适应性喂养3 d后，置于18 L熏烟箱中进行熏烟。每次3支香烟，3次/d，烟雾用60 ml注射器注入熏烟箱中。于9 am、12 am、3 pm进行，每次1 h，连续4 d后取材。脂多糖(LPS)组：小鼠进行常规喂养，于取材前24 h经4%戊巴比妥腹腔注射麻醉，切开气管处皮毛，充分暴露气管，微量注射器滴入10 μg LPS(浓度2 μg/μl)，滴注完成后倾斜上提小鼠躯体，轻揉按摩肺部，使LPS尽可能分布两肺。缝合颈部皮肤，待小鼠清醒后，置笼内正常饲养。对照组小鼠每天用60 ml注射器将空气注入18 L熏烟箱中，其余操作同熏烟组小鼠。

1.2.2标本采集 小鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，切开气管处皮毛，充分暴露气管，经环状软骨间隙切开一小口，插入气管灌洗管(剪成楔形的24G静脉留置针)，向肺内注入1.3 ml生理盐水，共回收约1 ml含免疫细胞的灌洗液，用于细胞计数及分类计数。完成气管灌注后切开胸腹，充分暴露心肺，用5 ml生理盐水进行心脏灌流，洗去肺中残存血液，切下两侧肺，滤干水分，分装3份，液氮处理后转移至-80℃保存，用于PCR检测。

1.2.3支气管肺泡灌洗液细胞计数及分类计数 将气道灌洗液离心3 000 r/min 10 min，去上清液，细胞沉渣重悬于100 μl生理盐水,加入500 μl的红细胞裂解液，混匀静置约2 min后离心2500 r/min，5 min。弃上清液，细胞沉淀重悬800 μl生理盐水，混匀取20 μl进行细胞计数，用Countstar自动细胞计数仪计算总细胞数,余重悬液进行HE染色涂片,按形态学标准进行细胞分类。

1.2.4细胞PDB诱导的细胞氧化应激测定 根据实验方案，选用不透光的黑色96孔板，每孔加入50 μl 细胞混悬液。PBD刺激组加入150 μl kreb′s工作液，20 μl PDB工作液，PBD阴性对照组加入170 μl kreb′s工作液，立即进行化学发光测定，每孔测定1 s，共30个循环。ROS含量(RLU/S/1 000 cell)=(测定值-空白值)/50 μl细胞数×1 000。

1.2.5PCR法测定肺组织细胞因子 使用

NucleoZOL试剂提取肺组织中的总RNA 后,用随机引物逆转录合成cDNA。按照TaKaRa扩增试剂盒说明书要求操作，根据2-ΔΔCT公式计算RNA的相对表达量。

2 结果

2.1香烟烟雾及LPS对小鼠体重的影响 与实验前相比，对照组小鼠体重未见明显变化(P>0.05)；熏烟4 d后，小鼠体重比熏烟前减少18.9%，其变化差异明显高于对照组和LPS组(P<0.01)；气管内滴注10 μg LPS 24 h后，小鼠体重无明显变化(P>0.05)。见表1。

2.2香烟烟雾及LPS对气道灌洗液细胞总数和分类计数的影响 与对照组相比，熏烟组小鼠气道灌洗液细胞总数、巨噬细胞计数，中性粒细胞计数和淋巴细胞计数均无明显变化,(P>0.05)；LPS组小鼠在LPS气道滴注24 h后，气道灌洗液细胞总数明显升高，高于对照组和熏烟组(P<0.01)并且巨噬细胞计数和中性粒细胞计数均高于对照组和熏烟组(P<0.01)。见表2、3，说明LPS诱导的免疫细胞募集以单核巨噬细胞和中性粒细胞为主。

2.3香烟烟雾和LPS对免疫细胞形态学的影响 对照组灌洗液中以巨噬细胞为主，偶见中性粒细胞和淋巴细胞。巨噬细胞胞体呈圆或不规则形，胞核形态圆形，深染，大部分细胞质量较少，粉红色，仅少量细胞细胞质量多，呈淡粉色；中性粒细胞通常呈杆状或2～3分叶状。熏烟组细胞以巨噬细胞为主，形态与对照组细胞一致。LPS组小鼠气道灌洗液可见大量中性粒细胞，细胞核多呈明显的3～5分叶状，偶见6～7分叶状，叶与叶间多有细丝相连；与对照组相比，巨噬细胞体积较大，圆形或不规则形，细胞质较多，淡染，内可见空泡；偶见单核细胞。见图1。

2.4香烟烟雾和LPS对细胞PDB诱导的细胞氧化应激影响 与对照组和熏烟组相比，LPS气管滴注的小鼠气道灌洗液细胞在PDB的诱导下具有更高的ROS产出率(P<0.01)，在非PDB的诱导的LPS组小鼠气道灌洗液细胞的ROS产出率仍较对照组和熏烟组高(P<0.01)。见表4。

GroupsPretest weight(g)Preset weight (g)Weight loss(%)Control group20.57±0.7321.00±1.660.01±3.08Smoke group19.98±0.5316.20±0.54-18.90±1.761)2)LPS group20.5±0.7621.40±0.754.39±1.2

Note:Compared to control group,1)P<0.01；compared to LPS group，2)P<0.01.

GroupsTotal cells(×105)Total macrophages(×105)Total neutrophils(×100)Total lymphocytes(×100)Control group2.86±0.82.66±0.78708.8±843.92 734.4±8 023.2Smoke group1.37±0.681.35±0.671 388.13±4 164.380.0±0.0LPS group6.41±1.982)3)3.11±1.421)3)252 799.93±79 050.362)3)451.58±1 497.7

Note:Compared to control group,1)P<0.05,2)P<0.01;compared to smoke group,3)P<0.01.

GroupsTotalmacrophages(%)Totalneutrophils(%)Totallymphocytes(%)Control group97.75±5.950.38±0.520.73±2.19Smoke group99.22±2.330.78±2.330.00±0.00LPS group49.33±19.701)3)42.29±11.942)3)0.04±0.15

Note:Compared to control group,1)P<0.05,2)P<0.01；compared to smoke group,3)P<0.01.

图1 香烟烟雾和LPS对免疫细胞形态的影响(HE×400)Fig.1 Effects of cigarette smoke and LPS on immune cell morphology (HE×400)Note: A.Control group;B.Smoke group;C.LPS group.Yellow arrows represented alveolar acrophages,black arrows represented activated macrophages,red arrows represented neutrophils,and blue arrows represented monocytes.

GroupsPDB+PDB-Control group53.73±30.585.37±8.32Smoke group27.72±16.51.87±1.58LPS group4 325.33±159.261)2)21.56±3.041)2)

Note:Compared to control group,1)P<0.01；compared to smoke group,2)P<0.01.

GroupsGM-CSFCXCL-15Control group1.111±0.1721.011±0.048Smoke group1.336±0.1981.035±0.585LPS group10.28±1.4821)2)0.817 3±0.135

Note:Compared to control group,1)P<0.01；compared to smoke group,2)P<0.01.

2.5肺组织中CXCL-15和GM-CSF的影响 与对照组相比，熏烟组小鼠肺组织中GM-CSF和CXCL-15的表达均没改变(P>0.05)。LPS气管滴注的小鼠肺组织中GM-CSF表达增高9.26倍(P<0.01)，但CXCL-15并未发生改变(P>0.05),见表5。

3 讨论

香烟烟雾中含有4 000多种化合物，其中包括了尼古丁、烟焦油、一氧化碳、甲醛、氨气和DDT等有毒物质[2]。吸烟可引起气道炎症，导致慢性支气管炎、慢阻肺的发生。据报道，短期香烟烟雾刺激小鼠气道可诱发气道急性炎症[3]，可表现为气道巨噬细胞和中性粒细胞增多，而LPS诱导的气道炎症具有相似特点[4,5]。因此,本文分别用香烟烟雾和LPS诱导气道的急性炎症反应，比较二者对气道免疫细胞的影响和区别。

在急性感染的过程中，体重下降往往代表了系统炎症的发生[6]。然而在本次实验中，4 d(9支烟)二手香烟烟雾暴露并未产生明显气道炎症，因此系统炎症产生的可能性较低。但熏烟组小鼠体重明显下降(18.9%)，体重下降程度高于既往文献报道(5%～10%)[7]。熏烟导致体重下降的原因有二，一是炎症促进新陈代谢，增加了能量消耗；二是尼古丁通过刺激神经受体、影响激素分泌和脂肪代谢，抑制食欲等减轻体重[8]。在本次实验中，短期熏烟并未导致气道炎症细胞明显增加，因此熏烟组动物体重下降可能主要是由于尼古丁导致。并且本次实验小鼠体重下降的幅度较大，这可能与香烟尼古丁的含量不同有关。LPS气道滴注24 h诱发了气道急性炎症，短时的急性炎症反应并未导致明显的体重下降。

与国外报道相比，本次实验中4 d(9支烟/d)香烟烟雾暴露并未诱发明显气道炎症反应，细胞数目低于国外报道。其原因可能为：①香烟中成分含量差异；②同种类小鼠基因型可能存在差异，从而导致对刺激的反应程度存在差异；③由于小鼠反应的差异，产生急性炎症峰值的时间可能有差异。相对于香烟烟雾，LPS可导致气道炎症细胞总数升高，主要表现为中性粒细胞数目升高，说明LPS可促进中性粒细胞在气道的聚集，符合急性炎症反应的特征。

免疫细胞的形态在一定程度上反映了其功能的状态。本次实验通过对气道灌洗液细胞涂片染色，发现短期(4 d)熏烟小鼠气道灌洗液细胞在巨噬细胞大小、形状、中性粒细胞核象方面与对照组并没有明显差别，说明短期熏烟并未引起小鼠气道免疫细胞形态变化。LPS导致气道巨噬细胞体积增大，形状不规则改变，细胞质增多，甚至空泡形成，说明单核细胞处于高度激活的状态；与此同时，LPS导致小鼠气道中性粒细胞核分叶增多，表明LPS可以诱导中性粒细胞成熟，增强中性粒细胞的吞噬功能。此外，LPS组细胞灌洗液中还可见少量单核细胞，说明LPS刺激诱导血液中的单核细胞向气道聚集，并可能在局部分化为巨噬细胞。

气道免疫细胞内ROS的产生，是其发挥免疫作用、杀灭微生物的主要途径之一[9]。PDB是公认的氧化应激产物诱导剂。本次实验中LPS组小鼠气道灌洗细胞在无PDB的诱导刺激下，与对照组相比，即产生较多的ROS，说明LPS有类似PDB的作用。而在PDB的诱导下，LPS组气道灌洗细胞产生的ROS约为对照组的80倍，说明LPS导致了气道免疫细胞的强氧化应激状态，该反应类似于宿主免疫细胞对微生物的反应。而熏烟4 d，并未导致气道灌洗细胞氧化应激状态的改变。

CXCL15表达于小鼠体内，是属于趋化因子家族中的一类细胞因子，其作用类似于CXCL8，可以促进中性粒细胞的募集，其在肺和肺上皮细胞中高表达[10]。本实验中，我们发现，尽管LPS导致气道中性粒细胞的聚集，但肺组织中CXCL15并未见明显升高，说明LPS并不通过CXCL15招募中性粒细胞聚集气道。GM-CSF具有促进中性粒细胞成熟和趋化中性粒细胞的作用[11,12]，有报道认为其为中性粒细胞的炎症的生物标志物。LPS组小鼠肺组织GM-CSF的表达明显升高，说明LPS可通过提高肺组织GM-CSF的表达，促进中性粒细胞的成熟和趋化。而香烟烟雾并未导致肺组织CXCL-15和GM-CSF表达升高，也未增加气道中性粒细胞的数量。

COPD在女性中发病率为5.1%[13]，既往COPD实验研究中多以雄性小鼠作为实验动物，缺乏雌性小鼠数据。基于香烟烟雾和LPS常用于COPD动物模型的建立，本研究在实验设计上选用了雌性小鼠作为研究对象，有别于其他实验研究。此外，本研究对照组通过向箱体内注入空气的方法进行“假熏烟”，排除了熏烟过程对小鼠造成的影响。但是并没有向对照组小鼠气管内滴注生理盐水，忽略了手术操作和生理盐水本身对气道免疫细胞的影响，此为本研究设计上的缺陷。但是根据既往研究数据表明，假手术组(气管内滴注生理盐水或PBS)跟空白对照组气道内炎症细胞总数并没有差异[14]，且本实验中对照组细胞总数与其他报道中假手术组细胞总数相似[14,15]，说明手术和生理盐水尚未构成对气道免疫细胞数量明显的影响，因此，在本次实验中未设LPS假手术组并未严重影响不同组别数据的可比性。

综上所述，10 μg LPS气道滴注可通过增加肺组织GM-CSF的表达，增加中性粒细胞的成熟和募集，并促进了气道免疫细胞内氧化应激反应及产生ROS的能力，而熏烟4 d未能产生气道炎症反应。在建立熏烟联合脂多糖的COPD动物模型之前，我们有必要了解香烟和脂多糖分别对气道炎症免疫的影响，在此基础上，进一步分析熏烟联合脂多糖对免疫细胞的交互影响，从而更好地了解并揭示吸烟和感染共同导致COPD的病理机制。本实验仅揭示了短期香烟烟雾对气道的急性炎症刺激作用和免疫反应，更长时间的香烟刺激以及合并反复感染的病理机制，有待进一步研究。