miR-34b抑制非小细胞肺癌A549的侵袭和迁移①

郭东明 张 奇 何东升 江跃全 王志强

(重庆大学附属肿瘤医院/重庆市肿瘤研究所/重庆市肿瘤医院，肿瘤转移与个体化诊治转化研究重庆市重点实验室,重庆400030)

肺癌是全球最为严重的恶性肿瘤，发病率和死亡率都居癌症之首。2012年全世界肺癌新增病例180万，占所有癌症新增病例的12.9%；肺癌死亡病例160万，占所有癌症死亡病例的19.4%[1]。肺癌包括两种组学亚型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中大部分为非小细胞肺癌，约占85%[2]。肺癌的治疗是人类医疗卫生系统的重大课题。MicroRNAs (miRs)是一种长度约为22个核苷酸的小型单链非编码RNA分子，在转录后水平调控基因表达。各种癌症中出现了许多异常表达的microRNAs，这些异常表达的microRNAs在致癌和癌症进展中起着重要作用[3]。大量研究表明在非小细胞肺癌的治疗中microRNAs已经成为研究热点[4,5]。miR-34家族包括miR-34a/b/c三个成员。miR-34b在乳腺癌、骨肉瘤及前列腺癌等癌症进程中发挥着重要作用[6-8]。据报道miR-34b在非小细胞肺癌组织中低表达，miR-34b表达水平与非小细胞肺癌患者肿瘤的转移性存在密切联系[9-11]。但关于miR-34b对非小细胞肺癌侵袭和迁移的调控作用的报道还十分罕见，miR-34b在肺癌中的具体作用还有待进一步研究。本文的主要目的是探究miR-34b对非小细胞肺癌A549侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1细胞系与主要试剂 非小细胞肺癌细胞系A549来源于美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。RPMI1640培养基、胎牛血清和转染试剂TurboFect Transfection Regent购自赛默飞世尔科技公司。miR-34b mimic和pc-HIF1α过表达载体由上海吉玛制药技术有限公司合成提供。RNA提取试剂盒和定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM购自大连TaKaRa公司。荧光素酶检测试剂盒来源于Promega公司。Transwell小室及人工基底膜购自美国BD公司。抗缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF1α)抗体，抗基质金属蛋白酶2(Matrix metalloprotein 2,MMP-2)抗体，抗Snail抗体和抗血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗体购自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 A549细胞于含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI1640培养基，并置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。当细胞增殖到70%～80%时进行传代。将A549细胞分为4组：A549 (空对照)组，miR-34b mimic组，pc-HIF1α组和miR-34b mimic+pc-HIF1α组。按照转染试剂TurboFect Transfection Regent的说明书向A549细胞单独或同时转染miR-34b mimic和pc-HIF1α过表达载体。

1.2.2实时定量PCR (Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 首先用RNA提取试剂盒提取总RNA后再反转成cDNA，然后用下列引物进行PCR，miR-34b上游引物：5′-TGCGTGTCGT-GGAGTC-3′，miR-34b下游引物：5′-GCGAATCACTAACTCCACT-3′。HIF1α上游引物：5′-TTGCTCAT-CAGTTGCCACTTCC-3′，HIF1α下游引物：5′-AGCAATTCATCTGTGCTTTCATGTC-3′。根据SYBR Premix Ex TaqTM说明书进行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt计算相对表达量。

1.2.3荧光素酶实验 用洗涤液对待测细胞进行洗涤，弃去洗涤液后在孔中加入1×细胞裂解液将细胞裂解。然后室温下于振荡器上振荡5～10 min，移入离心管中离心，3 000 r/min，5 min，离心后取上清进行发光测定。按照试剂盒说明书和仪器操作说明对待测样品进行发光值测定。

1.2.4蛋白印迹 首先用PBS清洗待测细胞3次后加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，100℃变性5 min。然后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜。经5%的BSA封闭1 h后加入相应的一抗，4℃过夜孵育，第二天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.2.5Transwell检测细胞侵袭 待测细胞用无血清的培养基制成1×106个/ml的细胞悬液，再将上述细胞悬液加入铺有人工基底膜的Transwell的上室中，同时在下室中加入含20%胎牛血清的培养基。37℃培养24 h后，用吉姆萨染色液对上室底部细胞进行染色，同时用棉签除去上室内侧的细胞。显微镜下观察并统计细胞数量。

1.2.6划痕检测细胞迁移 首先将待测细胞制成1×106个/ml的细胞悬液后加入6孔板中，过夜培养至形成单层细胞。在单层细胞上用10 μl的枪头划横线，PBS洗3次以洗去因划痕而脱落的细胞。显微镜下拍照测量划痕宽度，培养24 h后再取出拍照测量划痕宽度。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1转染miR-34b mimic对肺癌A549细胞miR-34b表达的影响 向肺癌A549细胞中转染miR-34b mimic后，利用qRT-PCR检测miR-34b表达。如图1所示，mimic-scramble组miR-34b表达与对照组差异无统计学意义。miR-34b mimic组miR-34b表达显著高于对照组(P<0.001)。由此可见，转染miR-34b mimic可提高肺癌A549细胞miR-34b表达。

2.2转染miR-34b mimic可降低肺癌A549细胞HIF1α的mRNA水平 生物信息学预测发现miR-34b与HIF1α存在靶向关系后，通过qRT-PCR检测HIF1α的mRNA水平。由图2可知，在A549细胞中转染mimic-scramble不会影响HIF1α的mRNA水平。转染miR-34b mimic后，A549细胞HIF1α的mRNA水平显著下降(P<0.001)。上述结果表明，转染miR-34b mimic可降低肺癌A549细胞HIF1α的mRNA水平。

2.3miR-34b直接靶向HIF1α 利用荧光素酶进一步验证miR-34b与HIFα的靶向关系。

图1 qRT-PCR检测miR-34b表达Fig.1 Expression of miR-34b was detected by qRT-PCRNote: ***.P<0.001 vs.A549 group.

图2 qRT-PCR检测HIF1α的mRNA水平Fig.2 mRNA levels of HIF1α were measured by qRT-PCRNote: ***.P<0.001 vs.A549 group.

图3显示，在HIF1α野生型细胞中转染miR-34b mimic后，荧光素酶活性显著减弱(P<0.01)。但向HIF1α突变型细胞中转染miR-34b mimic则不会影响荧光素酶的活性。以上结果说明，miR-34b可直接靶向HIF1α。

2.4miR-34b负向调控HIF1α表达 通过蛋白印迹检测HIF1α的蛋白水平，分析单独或同时转染miR-34b mimic和pc-HIF1α对肺癌A549细胞HIF1α蛋白水平的影响。

图3 荧光素酶验证miR-34b与HIF1α的靶向关系Fig.3 Targeted relationship of miR-34b and HIF1α was verified by luciferase assasyNote: **.P<0.01 VS.HIF1α wild type cells.

图4 蛋白印迹检测HIF1α的蛋白水平Fig.4 Protein levels of HIF1α were tested by Western blotNote: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

图5Transwell检测细胞侵袭

Fig.5CellinvasionwasdetectedbyTranswell

Note: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

图6 划痕实验分析细胞迁移Fig.6 Cell migration was tested by wound healingNote: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

如图4所示，miR-34bmimic组HIF1α蛋白水平显著低于对照组(P<0.01)。pc-HIF1α组HIF1α蛋白水平显著高于对照组(P<0.01)。与pc-HIF1α组相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α组HIF1α蛋白水平显著下降(P<0.01)。由此可见，miR-34b负向调控肺癌A549细胞HIF1α表达。

2.5miR-34b靶向HIF1α减弱细胞侵袭 为分析miR-34b对肺癌A549细胞侵袭的影响，Tanswell检测各组细胞侵袭。由图5可知，miR-34b mimic组每个视野下的侵袭细胞数目显著少于对照组(P<0.01)。pc-HIF1α组每个视野下的侵袭细胞数目显著多于对照组(P<0.01)。与pc-HIF1α组相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α组每个视野下的侵袭细胞数目显著变少(P<0.01)。上述结果表明，miR-34b可通过靶向HIF1α减弱肺癌A549细胞侵袭。

2.6miR-34b靶向HIF1α抑制细胞迁移 利用划痕实验分析miR-34b对肺癌A549细胞迁移的影响。图6显示，miR-34b mimic组划痕愈合率显著低于对照组(P<0.01)。pc-HIF1α组划痕愈合率显著高于对照组(P<0.01)。与pc-HIF1α组相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α组划痕愈合率显著降低(P<0.01)。以上结果说明，miR-34b可通过靶向HIF1α抑制肺癌A549细胞迁移。

图7 蛋白印迹检测侵袭和迁移相关蛋白的表达Fig.7 Expression of invasion and migration related proteins was measured by Western blotNote: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

2.7miR-34b靶向HIF1α对细胞运动相关蛋白表达的影响 通过蛋白印迹检测MMP-2、Snail和VEGF的表达，分析miR-34b对肺癌A549细胞运动相关蛋白表达的影响。如图7所示，miR-34b mimic组MMP-2、Snail和VEGF相对蛋白水平低于对照组(P<0.01)。pc-HIF1α组MMP-2、Snail和VEGF相对蛋白水平高于对照组(P<0.01)。与pc-HIF1α组相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α组MMP-2、Snail和VEGF相对蛋白水平下降(P<0.01)。由此可见，miR-34b可通过靶向HIF1α抑制A549细胞运动相关蛋白MMP-2、Snail和VEGF的表达。

3 讨论

肺癌是中国发病率和死亡率最高的癌症，中国的肺癌形势十分严峻，2012年中国新增肺癌病例70.48万，占全世界肺癌病例的39.2%；肺癌死亡病例56.94万，占全世界肺癌死亡病例的35.6%[12]。而且，中国的肺癌负担还在不断增加，2015年中国新增肺癌病例达73.33万，肺癌死亡病例达61.02万[13]。目前治疗肺癌最为普遍的方法包括外科手术、放疗、化疗，但这些方法仅对局部癌症的患者能起到较好的效果，而对已经发生转移的晚期癌症患者的治疗效果并不理想[14,15]。开发更加有效的治疗方法迫在眉睫。随着分子生物学的发展，靶向治疗受到了越来越多的关注。大量研究表明microRNAs在癌症的靶向治疗中具有很大的潜能[16]。

细胞的侵袭能力在癌症的转移过程中发挥着重要作用。许多microRNAs具有调控癌细胞侵袭的功能。有数据显示在A549细胞中miR-137过表达可负向调控PXN表达，降低细胞侵袭[17]。有研究发现miR-675-5p可通过抑制GPR55表达减弱A549细胞侵袭[18]。据报道miR-34a可通过负向调控神经母细胞瘤CD44表达抑制细胞侵袭[19]。有数据显示miR-34a和miR-34c可直接靶向Fra-1减弱乳腺癌细胞侵袭[20]。另外，在膀胱癌细胞中miR-34a可直接靶向HNF4G抑制细胞侵袭[21]。Garofalo等[22]发现在非小细胞肺癌H1703和Calu-6细胞中，miR-34a和miR-34c可通过降低PDGFR-α/β表达抑制细胞侵袭。本研究结果显示，在非小细胞肺癌A549中，miR-34b负向调控HIF1α表达，miR-34b可直接靶向HIF1α减弱细胞侵袭。

越来越多的研究表明microRNAs在癌细胞迁移方面也发挥着重要作用。据报道在非小细胞肺癌A549和H157细胞中，miR-153可通过靶向ADAM19减弱细胞迁移[23]。Wang等[24]发现在胃癌细胞中，miR-34a/b/c可通过靶向YY1降低细胞迁移。在食管鳞状细胞癌中，miR-34a可通过靶向MMP-2/MMP-9/ FNDC3B抑制细胞迁移[25]。另外，miR-34a还可通过负向调控AXL减弱卵巢癌细胞迁移[26]。有研究表明miR-34c-3p过表达可通过抑制eIF4E表达降低A549细胞侵迁移能力[27]。本文结果显示，miR-34b可通过靶向HIF1α抑制肺癌A549细胞迁移。

本研究表明，在非小细胞肺癌A549中，miR-34b负向调控HIF1α表达，miR-34b可直接靶向HIF1α减弱细胞侵袭和迁移，抑制运动相关蛋白MMP-2、Snail和VEGF的表达。后续研究将通过体内实验探索miR-34b在肺癌发生发展中的作用。