shRNA干扰IRS-1基因通过PI3K/AKT通路对人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1增殖和转移能力的调控作用①

江泽友 徐 灿 葛一漫

(成都中医药大学附属医院检验科，成都610072)

乳头状甲状腺癌是最常见的内分泌系统癌症，近几十年来发病率呈逐年上升的趋势[1,2]。研究表明，乳头状甲状腺癌常见早期癌细胞及淋巴结转移，是导致乳头状甲状腺癌患者病情恶化及死亡的主要原因[3]。放射性碘治疗是目前治疗转移性乳头状甲状腺癌的主要方法，但对于出现远端转移的乳头状甲状腺癌患者无显著疗效，10年内生存率不足10%[4]。并且长期进行放射性碘治疗还具有诱导继发白血病等的风险[5,6]。信号通路状态的异常改变是癌症发展的主要表现之一[7]。胰岛素受体底物-1 (Insulin receptor substrate-1,IRS-1)能调控多条与细胞生长及转移相关信号通路激活，如PI3K信号通路、MEK/ERK信号通路、JAK/STAST信号通路等[8]。研究发现，IRS-1的表达量与肺癌患者预后呈负相关[9,10]。但IRS-1能否影响乳头状甲状腺癌细胞生长和转移还未见报道。本文用shRNA沉默IRS-1以探究IRS-1在乳头状甲状腺中的作用及机制，以期为临床乳头状甲状腺治疗提供新的潜在靶标。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 CLARIOstar酶标仪购自德国BMG Labtech公司；ProFlex PCR仪购自美国Life Technologies公司；电泳仪、转膜仪和凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。RPMI1640细胞培养液、胎牛血清和0.25%胰酶购自美国Gibco公司 (货号：11875119，10099141，25200114)；转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒、TaqMan One Step PCR试剂盒和Annexin V试剂盒购自北京索莱宝公司 (货号：RP1100，T2210，CA1020)，BCA试剂盒购自碧云天生物科技公司 (货号：P0011)；Matrigel购自美国BD公司 (货号：354230)，Trizol试剂购自美国赛默飞公司(货号：15596026)；PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT一抗购自英国Abcam公司(货号：ab1678，ab8805，ab191606，ab38449) ，IRS-1抗体购自美国CST公司 (货号：3048)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人乳头状甲状腺癌细胞系TPC-1购自上海纪宁公司。用含有10%胎牛血清的RIPM1640培养液培养TPC-1细胞，培养环境条件为37℃，5%CO2。2 d换液一次。

1.2.2细胞转染 用胰酶收集细胞，用培养液将细胞密度调整为1×106个/ml并接种于12孔板中，将细胞随机分为TPC-1组、sh-scram组和sh-IRS-1组，根据转染试剂盒说明书用Lipofectamine 2000将sh-IRS-1转染进TPC-1细胞，shRNA转染sh-IRS-1组细胞，TPC-1组仅加入载体处理，转染6 h后将含有转染试剂的培养液更换为正常培养液继续培养，48 h 后进行检测。

1.2.3RT-PCR 用Trizol试剂提取转染后的细胞总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA。用PCR进行扩增后，根据TaqMan One Step PCR试剂盒说明书对mRNA进行定量分析，用β-actin作为内参。实验所用到的引物采用Primer3网站设计，由上海生工合成，引物序列如下：IRS-1 上游引物：5′-AGCCCAAAAGCCCAGGAGAATA-3′，下游引物：5′-TTCCGAGCCAGTCTCTTCTCTA-3′；β-actin上游引物：5′-TCGTGCGTGACATCAAAGAG-3′，下游引物：5′-TGGACAGTGAGGCCAGGATG-3′。

1.2.4Western blot 用RIPA试剂提取各组细胞蛋白，BCA试剂盒测定各组蛋白浓度。将各组蛋白浓度调平，用10% SDS-PAGE分离蛋白，半干法将蛋白质转移到PVDF膜，并用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，室温 2 h。2 h后加入适应浓度一抗于4℃封闭过夜，第二天洗净未结合一抗，加入二抗室温孵育 1 h，1 h后滴加显色液于暗室曝光显影，用凝胶成像系统获取蛋白质条带图片。以GAPDH为内参，用Image J软件对蛋白质含量进行半定量分析。

1.2.5MTT 将细胞接种于96孔板内，细胞密度为1×105个/ml。培养24 h后用sh-IRS-1转染细胞，分别连续培养0、1、2、3和4 d后，每孔加入10 μl MTT试剂，继续培养4 h后，每孔加入150 μl二甲基亚砜溶液，于摇床上低速振荡混匀后，用酶标仪于570 nm处检测细胞吸光度，计算细胞增殖倍数。

1.2.6Transwell 将转染后细胞消化接种于用Matrigel预先包被的Transwell小室上层中，用无血清培养液进行培养，小室下层6孔板中则加入正常细胞培养液。连续培养48 h后，擦去小室上层未侵袭的细胞，用结晶紫将侵袭细胞染色，于显微镜下观察，每孔随机选取6个视野进行计数统计。

1.2.7划痕实验 实验前一天用记号笔于12孔板背面划出5条平行直线，消毒灭菌后备用。实验当天将细胞接种于12孔板内，用sh-IRS-1对细胞进行转染后培养24 h，第2天用10 μl枪头垂直于培养板背面划痕，用预冷的PBS将划下的细胞洗净后，加入无血清培养液继续培养24 h，用显微镜拍照，每孔选取3个视野，测量划痕宽度，计算划痕闭合率，划痕闭合率=(初始划痕宽度-24 h划痕宽度)/初始划痕宽度×100%。

2 结果

2.1sh-IRS-1对IRS-1表达的影响 如图1所示，与sh-scram组比较，sh-IRS-1组TPC-1细胞IRS-1的mRNA表达水平明显降低 (P<0.01，图1)；同时，sh-IRS-1组TPC-1细胞IRS-1的蛋白表达水平也明显低于sh-IRS-1组，差异有统计学意义(P<0.01，图1)，提示转染成功。

2.2下调IRS-1表达对细胞增殖能力的影响 sh-IRS-1转染细胞后3 d和4 d，sh-IRS-1组细胞增殖倍数显著低于sh-scram组，差异有统计学意义 (P<0.05，图2)；同时，与sh-scram组比较，sh-IRS-1组细胞凋亡率明显升高 (P<0.01，图3)，表明下调IRS-1表达能降低人乳头瘤甲状腺癌细胞增殖能力。

2.3下调IRS-1表达对细胞转移能力的影响 Transwell实验结果表明，与sh-scram组比较，sh-IRS-1组细胞侵袭数明显减少 (P<0.01，图4)；同时，sh-IRS-1组TPC-1细胞划痕闭合率明显低于sh-scram组，差异具有统计学意义 (P<0.01，图5)，表明下调IRS-1表达能降低TPC-1细胞的转移能力。

图1 sh-IRS-1对TPC-1细胞IRS-1的mRNA和蛋白质表达的影响Fig.1 Effects of sh-IRS-1 on mRNA level and protein level of IRS-1Note: RT-PCR and Western blot were performed for mRNA level and protein level of IRS-1.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.All experiments were repeated at least three times,β-actin was used as loading control of RT-PCR,GAPDH was used as loading control of Western blot.

图2 sh-IRS-1对TPC-1细胞增殖的影响Fig.2 Effect of sh-IRS-1 on cell proliferation of TPC-1 cellsNote: Cell viability was measured by MTT assay.n=6,*.P<0.05 versus with sh-scram group.

2.4下调IRS-1表达对PI3K/AKT信号通路的影响 Western blot实验结果发现，sh-IRS-1能抑制TPC-1细胞p-PI3K和p-AKT表达，能显著降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值 (P<0.01，图6)，表明下调IRS-1表达能抑制TPC-1细胞PI3K/AKT信号通路激活。

图3 sh-IRS-1对TPC-1细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of sh-IRS-1 on apoptosis of TPC-1 cellsNote: Cell apoptosis rate was determined by flow cymetory.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.

图4sh-IRS-1对TPC-1细胞侵袭能力的影响

Fig.4Effectofsh-IRS-1oninvasionabilityofTPC-1cells

Note: Transwell assay was employed to measure invasion ability of TPC-1 cells.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.

图5 sh-IRS-1对TPC-1细胞迁移能力的影响Fig.5 Effect of sh-IRS-1 on migration ability of TPC-1 cellsNote: Migration ability of TPC-1 cells was determined by wound healing assay.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.

图6 sh-IRS-1对PI3K/AKT信号通路的影响Fig.6 Effect of sh-IRS-1 on PI3K/AKT signaling pathwayNote: The expressions of PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT were measured by Western blot.GAPDH was used as loading control.n=6,**.P<0.01 versus sh-scram group.

3 讨论

乳头状甲状腺癌是最常见的甲状腺癌类型，约占所有甲状腺癌的80%[11]。一般而言，早期乳头状甲状腺癌经过手术治疗可以基本治愈[12]。但约有50%的乳头状甲状腺癌患者都具有癌细胞转移的倾向，这类患者预后往往较差，并且具有较高的死亡风险[13,14]。因此，了解乳头状甲状腺癌细胞转移的机制、寻找治疗的新靶标是降低死亡率的关键。IRS-1是一类与胰岛素抵抗形成相关因子，能够调节细胞新陈代谢和细胞有丝分裂过程[15]。Hua等[16]研究发现IRS-1在子宫内膜癌中表达异常增多，与患者的预后呈负相关。IRS-1与乳腺癌的发生发展密切相关[15]。IRS-1还能促进恶性间皮细胞瘤细胞的生长[17]。有研究表明IRS-1在肝癌早期的高表达能促进肝癌患者的存活，但也有研究报道IRS-1的高表达能够促进肝癌细胞的生长[8,18]。据研究报道，IRS-1在甲状腺癌中表达也显著升高，IRS-1的激活与甲状腺癌患者较差的预后有关[19]。但还未见文献报道IRS-1在乳头状甲状腺癌中的作用。在本研究中，我们设计合成shRNA干扰乳头状甲状腺癌TPC-1细胞IRS-1的表达发现，sh-IRS-1能显著降低IRS-1的mRNA表达水平和蛋白质表达水平，表明shRNA能抑制TPC-1细胞IRS-1的表达。TGFβ/Smad3能通过下调IRS-1在结肠癌细胞中的表达水平抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡[20]。本文研究表明，sh-IRS-1转染细胞后的3 d和4 d，细胞增殖速度显著低于sh-scram组，并且sh-IRS-1还能显著升高TPC-1细胞的凋亡率，表明下调IRS-1的表达水平能抑制乳头状甲状腺癌TPC-1细胞增殖、诱导癌细胞凋亡，从而抑制TPC-1细胞生长。

研究表明，IRS-1在调控癌细胞侵袭和转移的过程中发挥着重要作用[21]。Gibson等[22]的研究发现，敲除IRS-1能促进乳腺癌肿瘤的转移。下调IRS-1表达能促进头颈部鳞状细胞癌的转移[23]。但在乳腺癌、前列腺癌和神经母细胞瘤中，IRS-1能诱导癌细胞的转移，升高癌细胞的运动能力[21,24]。IRS-1表达水平的异常升高与鼻咽癌的淋巴结转移有关[25]。miR-128也可通过调控IRS-1的表达抑制结肠癌细胞生长和转移[26]。本文研究结果表明，用shRNA干扰IRS-1表达后，乳头状甲状腺癌TPC-1细胞侵袭及迁移能力明显减弱，表明下调IRS-1表达能抑制TPC-1细胞侵袭和迁移，降低TPC-1细胞的转移能力，提示IRS-1在乳头状甲状腺癌中可能发挥促癌作用。

PI3K/AKT信号通路是调控细胞生长、分化和转移的主要信号通路之一，在乳头状甲状腺癌中处于过度激活的状态[27]。研究表明，IRS-1是PI3K/AKT信号通路的主要调控分子之一，IRS-1可通过调控PI3K/AKT信号通路的激活影响癌细胞的增殖、凋亡和转移。Wu等[26]研究发现，miR-128抑制结肠癌细胞增殖和迁移的作用与通过下调IRS-1表达抑制PI3K/AKT信号通路激活有关。GPCRs促进PI3K/AKT信号通路的激活与促进IRS-1表达有关[28]。在本研究中，下调IRS-1能抑制p-PI3K和p-AKT表达，即抑制PI3K和AKT磷酸化，显著降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值，表明sh-IRS-1能抑制PI3K/AKT信号通路激活。

综上所述，sh-IRS-1能降低乳头状甲状腺癌TPC-1细胞增殖速度、侵袭及迁移能力，还能升高TPC-1细胞的凋亡率；同时，sh-RNA还能显著降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值，表明shRNA干扰IRS-1能降低人乳头状甲状腺癌TPC-1细胞增殖及转移能力，作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路激活有关。本研究首次探究了IRS-1在人乳头状甲状腺癌中的作用并初步探讨了作用机制，可能为抑制乳头状甲状腺癌的转移提供新的潜在治疗靶标。