IL-15对异基因抗原刺激下人CD8+T 细胞增殖分化影响的初步研究①

冯 富 刘艳君 刘桂欢 张 华 朱漫漫 朱 平 刘久敏 余玉明

(南方医科大学第二临床医学院，广东省人民医院泌尿外科(广东省医学科学院)，广州510080)

以调节性T细胞为中心的移植免疫耐受诱导研究在近二十年成为人们研究的热点[1,2]。其中人CD28-CD8+抑制性T细胞(T suppressor cells,Ts)作为一种异体抗原免疫的重要调节细胞逐渐引起人们的重视。人CD28-CD8+Ts在不同疾病环境和移植免疫中均被证明发挥着重要作用[3-6]。我们之前的研究利用白细胞介素15(Interleukin 15，IL-15)联合其他细胞因子[7]或单独应用IL-15，并在异体抗原刺激下，在体外大量扩增出具有抗原特异性抑制作用的人CD28-CD8+Ts细胞。在研究中我们发现，人CD8+T细胞经过体外扩增产生CD28-CD8+Ts细胞的同时，也产生具有细胞毒性的CD28+CD8+T细胞。由此，我们提出疑问，相较于特异性免疫应答中CD8+T细胞受到病原体活化后发生增殖分化的特点，在本实验体系中，在外源性IL-15和同种异体抗原刺激下，CD8+T细胞增殖分化的特征如何？扩增产生的细胞毒性CD28+CD8+T细胞与人外周血新鲜分离的CD28+CD8+T细胞有何异同？针对以上问题的研究对揭示同种异体抗原刺激下人CD8+T细胞增殖分化特征具有重要意义，对理解临床移植环境下移植排斥反应和耐受诱导及监测具有重要参考价值。由此，我们对CD28-CD8+Ts细胞体外扩增体系下CD8+T细胞增殖分化的动态规律进行了研究，并报告如下。

1 材料与方法

1.1研究对象样品来源与HLA配型 人外周单个核细胞(PBMC)样品均来源于已签署知情同意书的健康志愿者(本次实验研究共招募健康志愿者131位，以在校大学生为主)。由深圳市亿立方生物技术有限公司用分子生物学方法进行HLA配型检测。选择HLA-A，-B 和-DR完全错配的志愿者分别设为A,B和I个体分别模拟供、受者和无关者组成多个实验组。

1.2方法

1.2.1PBMC分离和细胞分选 采集健康志愿者新鲜外周静脉血，肝素抗凝。将血液样本加入淋巴细胞分离液中，采用密度梯度离心分离PBMC。分别用CD8和CD4免疫磁珠试剂盒(应用Miltenyi Biotech公司产品)分离纯化CD8+T细胞(纯度>98%)和CD4+T细胞(纯度>98 %)，分离步骤按照产品说明书进行。新鲜的PBMC用CD2免疫磁珠试剂盒(应用Miltenyi Biotech公司产品)进行阴性选择，去除CD2+细胞，获取抗原提呈细胞(APC)。将IL-15体外诱导后的细胞应用CD28免疫磁珠试剂盒(Miltenyi Biotech公司产品)进行选择，分别获得CD28-CD8+T细胞(纯度>95%)和CD28+CD8+T细胞(纯度>98%)。

1.2.2CD28-/CD28+T细胞的体外诱导 培养基为RPMI1640培养液，加入胎牛血清(均为Gibco公司产品)，组成体积分数为15%的完全培养基。来源于A个体的2×106个CD8+T细胞作为反应细胞，B个体的1×106个HLA完全错配的APC作为刺激细胞，置于24孔细胞培养板，加入含有IL-15(50 ng/ml，PeproTech公司产品)的2 ml培养基中，置于37℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养，分别在第3、5和7天更换新鲜培养基。培养第5、7天收获每孔细胞，洗涤并分为2孔，继续培养，第9天收获细胞，并按照前述方法分离纯化出CD28-T细胞和CD28+T细胞，用于后面的毒性检测及表型检测实验。

1.2.3CD28-/CD28+T细胞的细胞毒性或细胞杀伤活性 作为靶细胞的APCs标记有两种浓度CFSE荧光：标记有高浓度(2.0 μmol/L)CFSE的原致敏APCs(B-APC-CFSEhigh)和标记低浓度(0.2 μmol/L)CFSE来自HLA-A,-B和-DR全错配无关供者的APCs(I-APC-CFSElow)。在同种异体APCs存在下，IL-15体外诱导的CD28-CD8+T细胞和其对应的CD28+CD8+T细胞分别作为效应细胞。将I-APC-CFSElow∶B-APC-CFSEhigh的比值设定为R。培养0、24、72和120 h后，利用流式细胞仪检测I-APC-CFSElow和B-APC-CFSEhigh细胞数目，计算不同时间点I-APC-CFSElow和B-APC-CFSEhigh细胞数的比率R，不同时间点该比率的变化反映了效应细胞对靶细胞群B-APC-CFSEhigh的特异性杀伤作用。

1.2.4流式细胞术分析 本研究实验所采用的抗人流式荧光单克隆抗体均购自eBioscience公司，包括：别藻青蛋白(APC)标记的抗人CD4和CD28单克隆抗体，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人CD2和CD122单克隆抗体，藻红蛋白(PE)标记的抗人Perforin、CD25、CD178(FasL)、CD215、Granzyme B和CD132单克隆抗体，PE和花青苷5(Cy5)标记的抗CD8单克隆抗体，以及相关同型对照抗体。染色方法按照产品说明进行，染色后应用LSR Fortessa 流式细胞仪(BD Bioscience 公司)进行数据收集，用FlowJo vX.0.7 软件进行数据分析。

2 结果

2.1IL-15体外扩增产生的CD28+CD8+和CD28-CD8+T细胞具有相反的细胞毒特性 将A-CD8+T细胞作为反应细胞，B-APCs作为刺激细胞，经IL-15体外扩增出的CD28-CD8+Ts和CD28+CD8+T细胞分别作为假定的杀伤细胞，将原致敏B-APCs(B-APC-CFSEhigh)和HLA完全错配的I-APC(I-APC-CFSElow)作为靶细胞共同培养。如图1所示，在0、24、72和120 h，当培养体系中只有B-APCs与I-APCs时，R值在各检测时间点均维持不变(R=1)；当将CD28+CD8+T细胞加入培养体系后，在72和120 h R值分别升高为1.25和2.57；而当将CD28-CD8+Ts加入培养体系后，R值在各个时间点均维持不变(R=1)。结果表明，CD28+CD8+T细胞与原致敏B-APCs相接触时，可以特异性地杀伤B-APCs导致R值增高，具有细胞毒性；而CD28-CD8+Ts对原致敏细胞(B-APCs)则不产生特异性的毒性杀伤作用。

2.2IL-15扩增后CD28+CD8+和CD28-CD8+T细胞的表型特性 我们检测了异体抗原刺激下，IL-15扩增产生的CD28+CD8+和CD28-CD8+T细胞与正常人外周血新鲜分离的相应细胞亚群的表型并进行对比。如图2A所示，正常人外周血新鲜分离的CD28-CD8+T细胞高表达CD122[(40.15±3.18)%]、颗粒霉素-B[(73.00±3.25)%]和穿孔素[(79.25±5.44)%]等分子，低表达 CD215[(0.10±0.02)%]、CD25[(0.67±0.33)%]和FasL[(0.04±0.01)%]等分子。经IL-15诱导扩增后的CD28-CD8+Ts低表达了CD122[(7.69±0.13)%]、颗粒霉素-B[(4.33±0.52)%]和穿孔素[(0.44±0.06)%]等分子，而高表达了CD132[(68.20±2.83)%]和CD25[(81.50±4.53)%]，其中FasL[(0.06±0.03)%]维持低水平表达。而与正常人外周血新鲜分离的CD28+CD8+T细胞相比，经IL-15诱导后CD28+CD8+T细胞高表达了CD25(88.26±14.03)、CD122(6.31±0.06)、CD132(60.43±16.99)、FasL(6.65±3.23)、颗粒霉素-B(23.80±1.13)和穿孔素(6.04±0.48)分子(图2B)。虽然不同组个体的CD28+CD8+和CD28-CD8+T细胞表面分子表达情况存在个体差异，但在3次独立实验中，表型上调或下调的趋势保持一致。

2.3IL-15对CD28+T细胞膜上CD28分子的影响 为了进一步了解IL-15诱导异体抗原刺激下CD8+T细胞增殖分化的机制，对CD28分子在不同培养条件下的动态规律进行了观察。我们发现，如图3A所示，在正常人外周血新鲜分离的CD8+T细胞中，CD28-细胞亚群只占很小比例，远低于CD28+细胞，CD28-/CD28+T细胞数比例为0.24；当CD8+T细胞与异体抗原培养9 d后，CD28-/CD28+T细胞数比进一步降至0.15；但是，若在异体抗原刺激下，同时加入IL-15，CD28-/CD28+T细胞数比反而升高至1.01。表明IL-15可促进CD28-CD8+T细胞的增殖分化。进一步将外周血新鲜分离的CD28+CD8+T细胞与异体抗原提呈细胞共同培养(图3B)，发现增殖细胞中CD28+T细胞占绝大多数(95.42%)；当在培养体系中加入IL-15时，增殖细胞中CD28+T细胞比例显著减少(61.60%)，而CD28-T细胞比例明显增多(P<0.05)。以上结果显示，CD8+T细胞在异体抗原刺激下进行增殖分化，如果无IL-15存在，增殖分化的细胞将主要是CD28+T细胞，如果加入IL-15，CD28-T细胞无论从数量上，还是增殖的比例上都将显著增加，即IL-15更偏向促进CD28-CD8+T细胞增殖。

图1 CD8+T细胞扩增产生的CD28-CD8+和CD28+CD8+T细胞具有不同的细胞毒特性 (n=3)Fig.1 CD28-CD8+and CD28+CD8+T cells expanded from CD8+T cells have adverse cytotoxic characteristics (n=3)

图2 IL-15诱导CD28-/CD28+T细胞的表型特性(n=3)Fig.2 Phenotypic characteristics of CD28-/CD28+T cells induced by IL-15 (n=3)

图3 IL-15对CD8+T细胞增殖分化中CD28分子的影响 (n=3)Fig.3 Effect of IL-15 on CD28 molecules during the proliferation of CD8+T cells(n=3)

3 讨论

CD8+T细胞是特异性免疫应答的主要效应细胞，可特异性识别、杀伤靶细胞或病原体[8]，在移植免疫中，CD8+T细胞识别异基因抗原，活化增殖后可杀伤异基因细胞，破坏移植物，参与排斥反应。我们前期研究通过IL-15联合其他细胞因子或单独应用IL-15，可在体外扩增出大量CD28-CD8+Ts细胞，这些细胞具有抗原特异性抑制作用而无细胞毒作用；但同时发现，一同扩增产生的CD28+CD8+T细胞具有抗原特异性细胞毒作用。本实验体系中，在IL-15诱导下，CD8+T细胞经B-APCs刺激增殖产生的CD28+CD8+T细胞可特异性地杀伤B-APC-CFSEhigh，但对HLA完全错配的无关供者I-APC-CFSElow无细胞毒性作用，说明由CD8+T细胞增殖分化而来的CD28-CD8+和CD28+CD8+T细胞具有完全不同的特性。

有研究显示，CD28-CD8+Ts能促进耐受性的树突状细胞(DC)发生增殖并增加其在同种异体心脏移植受者中表达[9]，还可诱导移植免疫耐受，使器官移植术后免疫抑制药物用量大大降低[10]，但也有研究表明，器官移植后患者体内CD28-CD8+T细胞增加与移植器官预后不良相关[11]。本研究结果提示，上述两种看似矛盾的观点可能缘于同一种细胞增殖分化过程，即异基因抗原刺激下，受者体内CD8+T细胞增殖分化为CD28-CD8+和CD28+CD8+T细胞两种具有不同功能的亚群，在复杂环境下出现某种亚群占优势的情况。

图2结果进一步表明，体外扩增产生的CD28-CD8+Ts与外周血新鲜分离的CD28-CD8+T细胞相比，低表达FasL、颗粒霉素-B和穿孔素等分子，扩增后同时产生的CD28+CD8+T细胞与外周血新鲜分离的同类细胞相比，高表达FasL、颗粒霉素-B和穿孔素分子，这些分子被公认为CTL发挥细胞毒性杀伤靶细胞的效应性分子[12-14]，进一步解释了IL-15诱导产生的CD28-CD8+Ts不具有细胞毒功能，而CD28+CD8+T细胞可特异性地杀伤靶细胞，具有细胞毒功能。

IL-15可以诱导CD8+T细胞增殖及分化为效应性或抑制性T细胞[7,15]。其在T细胞膜上具有异源三聚体受体，包括α受体(CD215)、β受体(CD122)和γ受体(CD132)[16]。与外周血新鲜分离的CD28-CD8+T细胞相比，体外扩增产生的CD28-CD8+Ts上调了CD132(IL-15Rγ)表达，下调了CD122(IL-15Rβ)表达，CD215(IL-15Rα)表达维持低表达水平；与外周血新鲜分离的CD28+CD8+T细胞相比，体外扩增产生的CD28+CD8+T细胞上调了CD132(IL-15Rγ)表达，同时上调了CD122(IL-15Rβ)表达，CD215(IL-15Rα)表达维持低表达水平。提示IL-15可能主要通过IL-15γ受体(CD132)促进CD28-CD8+Ts和CD28+CD8+T细胞增殖[16]；CD122(IL-15Rβ)分子可能与细胞毒性相关[17,18]。CD25分子高表达，表明了IL-15诱导产生的两群细胞高度活化成为具有相应功能的细胞。

IL-15可诱导CD8+T淋巴细胞增殖[19]，但在移植环境下，IL-15影响CD8+T淋巴细胞增殖分化的动态规律研究较少。本研究发现(图3A)，正常人外周血CD8+T细胞中，CD28+CD8+T细胞占据较大比例，加入异基因抗原提呈细胞刺激后，CD8+T细胞将增殖分化，但增殖分化的细胞中，CD28+CD8+T细胞仍然占据较大比例；但是，当加入IL-15后，增殖分化的细胞中CD28-CD8+T细胞反而占据较大比例。外周血新鲜分离的CD28+CD8+T细胞与异基因APC培养后，增殖细胞绝大多数仍然是CD28+表型，但是当加入IL-15后，CD28-表型显著增加(图3B)。以上研究表明，在异基因移植环境下，IL-15显著提高了CD28-CD8+T细胞增殖，还可诱导CD28+CD8+T细胞膜上CD28分子丢失。有研究表明，人肾小管上皮细胞可以产生IL-15[20,21]，IL-15也是外周CD28-CD8+T细胞存活的必需细胞因子[22]。这是否提示人类异基因移植后，患者体内可以通过分泌IL-15提高体内的CD28-CD8+Ts水平，从而协助维护机体达成临床免疫耐受？这或许解释了移植术后患者体内可检测出较高水平的CD28-CD8+Ts的原因[23]。但是，研究也显示，人体内IL-15处于极低表达水平[16]，移植后如何影响CD8+T细胞的增殖分化仍然不清楚。此外，鉴于IL-15诱导产生CD28-CD8+Ts的同时也产生具有细胞毒作用的CD28+CD8+T淋巴细胞，如何理清异基因移植环境下CD8+T细胞增殖分化的确切规律，仍需要结合临床病例进一步深入研究。

综上，本研究结果显示，在外源性IL-15和同种异体抗原刺激下，CD8+T细胞增殖分化后产生CD28-CD8+Ts细胞的同时也产生具有细胞毒特性的CD28+CD8+T细胞。两个细胞亚群表现出不同的表型特征。IL-15通过调节CD28分子的表达影响CD8+T细胞对异基因抗原的增殖分化。本研究对揭示临床移植环境下，异基因抗原刺激下人CD8+T细胞增殖分化特征，对理解移植排斥反应和耐受诱导及监测具有重要意义。