荧光原位杂交技术在唐筛高危人群产前诊断中的应用

李 翠，赵明刚，赵 乐，王晓岩，王 翔

(1.西安交通大学第一附属医院转化医学中心;2.检验科，陕西 西安 710061)

近年来，出生缺陷已成为全球性的人口健康问题[1-2]。在我国，出生缺陷总发生率约为5.6%，且每年新增出生缺陷数高达90万例[3]。出生缺陷已严重影响人口素质和群体健康水平[4]。据报道，目前70%的出生缺陷由于遗传因素所致，其中染色体异常较为常见。在产前诊断染色体异常中，最常见的是21染色体、18染色体、13染色体及性染色体的非整倍体，占染色体数目异常的80%以上[5]。由于染色体疾病目前并无有效的治疗方法，针对上述常见染色体异常进行产前筛查和诊断，能够有效防止此类患儿的出生，提高人口素质。

产前筛查主要通过对孕妇血液中的特异指标进行检测，从而筛选出高风险人群。然后针对高风险人群进行相关产前诊断进行确诊。产前诊断通过绒毛活检、羊水穿刺及胎儿脐静脉穿刺等手段获取胎儿细胞，从而对胎儿染色体核型进行分析。中孕期羊水穿刺在临床上应用最为广泛。但是，羊水细胞培养过程均为手工操作，耗时较长，且存在失败的可能，效率较低[6]。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybri￣dization，FISH)技术利用碱基互补配对原则将荧光标记的探针与目的DNA杂交[7]，通过荧光显微镜观察杂交后荧光信号的数量及类型进行判断。FISH检测所需细胞较少，且无需细胞培养，能快速直观地对常见的染色体非整倍体进行诊断[8]。本研究通过对218例唐筛高危孕妇的羊水细胞进行FISH及染色体核型分析检测，进一步探讨FISH在唐筛高危人群快速产前诊断中的应用价值。

1研究对象与方法

1.1临床资料

选择2012年1月至2016年1月由于唐筛高风险在西安交通大学第一附属医院行羊水穿刺的孕妇218名，平均年龄29.99岁(20～42岁)，平均孕周20+2周(16～33周)。

1.2羊水穿刺取材

在超声引导下经腹壁、子宫壁进入羊膜腔抽取羊水25mL，此过程严格进行无菌操作。其中20mL羊水用于细胞培养及染色体核型分析，5mL羊水用于FISH检测。

1.3 FISH检测

1.3.1 FISH探针

FISH探针购于美国VYSIS公司。21号和13号探针分别用橘红色和绿色荧光标记，18号、X和Y染色体探针分别用蓝色、绿色和红色荧光标记。

1.3.2羊水细胞处理

将5mL羊水置于15mL无菌离心管中，1 000r/min离心10min，弃去上清，常规低渗固定处理，滴片，70℃烤片1h。将玻片置于2×SSC溶液中，37℃孵育1h，再置于胃蛋白酶工作液中消化15min，2×SSC漂洗两次后，将玻片分别放置于70%乙醇、80%乙醇、100%乙醇中脱水处理1min，自然干燥后，将10μL FISH探针混合物加到玻片杂交区，加盖盖玻片，封片后放入杂交仪中杂交过夜。漂洗玻片后，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐染料(4',6-Diamidino-2-Phenylindole,DAPI)复染，荧光显微镜下计数细胞。

1.4羊水细胞G显带核型分析

将15mL羊水离心后，弃上清，将羊水细胞接种至无菌培养瓶中，静置培养1周后，换液后24～48h内收获细胞，常规制片，进行G显带核型分析。按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2013年)》标准进行染色体核型分析。每例计数30个细胞分裂相，分析5个核型。若为异常核型，则适当增加计数及分析的核型。

1.5随访

于孕妇产后1～6个月，对其进行电话随访。218例患者均随访成功，随访率为100%。

2结果

2.1 FISH检测结果

在218例孕妇中，共检出染色体异常9例，染色体异常率为4.13%，其中21-三体5例，18-三体2例，13-三体1例，45X[25]/46,XY[75]1例，见表1。

2.2羊水细胞培养及染色体核型分析结果

218例羊水均培养成功，共检出染色体异常11例，染色体异常率为5.04%，其中21-三体5例，18-三体2例，13-三体1例，45X[32]/46,XY[68] 1例，平衡易位1例，染色体多态性1例，见表1。

2.3随访

染色体异常病例相关料见表2。其中9例已引产，其余2例异常染色体核型的胎儿已出生，目前发育良好，未见明显异常，另207例结果正常胎儿目前均已出生，生长发育良好，未见异常。所有出生胎儿将对其进行持续随访。

表1异常核型结果对比分析(n)

Table 1 Comparative analysis of abnormal chromosome karyotype (n)

表2胎儿染色体异常病例的临床信息

Table 2 Clinical information of cases of chromosomal abnormality

3结论

3.1染色体病与唐氏综合征

染色体病在新生儿中发病率为0.5%～0.7%[9]，其中21-三体综合征发病率最高。21-三体综合征也称唐氏综合征，其在新生儿中发病率为1/800～1/600[10]。据文献报道，约2/3的唐氏综合征胎儿在妊娠早、中期会发生自发流产或胎死宫内，因此，其实际发病率较新生儿发病率高[11]。唐氏综合征主要临床表现为中重度智力低下，体格发育迟缓，伴随多器官功能障碍等。由于唐氏综合征目前尚无法治愈，给患者家庭和社会带来很大的经济和精神负担[12-13]。而孕中期唐氏筛查可以很好地检出高危人群，并通过产前诊断进行确诊。

对于唐氏综合征的产前诊断，最常用的是对孕中期羊水细胞进行染色体核型分析，这也是目前临床上的金标准。但是，由于核型分析不仅需要细胞培养，耗时较长，而且对相关技术人员要求较高，分析结果易受到细胞生长状态、显带技术及操作人员技术的影响导致失败[14]。因此，临床上需要一种快速、简便、准确的方法对唐筛高危人群进行检测。

3.2 FISH技术的优势探讨

FISH技术应用于羊水细胞数目异常检测，实验过程并不需要细胞培养，且操作简单、快速，结果直观易于观察。对于未培养的羊水，只需要少量羊水，即可在24h内阅片分析结果，大大缩短了孕妇等待的时间，缓解其紧张情绪[8]。因此，对于唐筛高危人群来说，FISH技术可以提供快速诊断。

本研究对218例唐筛高危患者的羊水细胞进行FISH检测，共检出21-三体5例，18-三体2例，13-三体1例，检出率分别为：2.29%、0.92%、0.46%。此外，还检测出1例45X[25]/46,XY[75]，检出率为0.46%。但是，对于平衡易位和染色体多态性的病例，FISH技术未能检出。

已有研究发现，羊水细胞培养过程中，可能存在来自于某单个细胞形成的细胞株而出现异常核型，从而造成嵌合核型的现象。而FISH技术不需要细胞培养，是此类假嵌合现象的较好的验证方法。此外，研究者还指出FISH技术应用于染色体非整倍体的检测结果基本与染色体核型分析结果一致[15]。但是由于FISH技术受探针种类的限制，只能用特异探针检出已知的染色体异常，很难在一次实验中检出所有的染色体数量异常及染色体重排等结构异常，这与本研究结论一致。

3.3结论

综上所述，FISH技术能够避免由于细胞培养失败带来的检测失败，且大大缩短了报告时间；而核型分析能够弥补FISH检测局限性等问题。临床上FISH联合羊水细胞培养核型分析，能够更全面快速地对唐筛高危人群提供产前诊断信息。