重组质粒pGEM-HERV-K gag的构建与鉴定

张宗彦,张 雯,刘妙龄,贲亚琍

（江汉大学：1医学院免疫疾病研究所；2学生工作部，湖北武汉 430000）

T载体为线状的DNA片段，3’端带有突出的“T”尾，同时Tap酶在PCR产物的5’末端加上非模板依赖性A碱基。TA克隆技术利用T碱基与A碱基互补配对，快速准确的使PCR产物在连接酶的作用下与T载体粘性连接，重组为环状DNA分子，从而极大提高克隆效率。人类内源性逆转录病毒（Human endogenous retrovirus sequences,HERVs）普遍存在于人类染色体中，是与逆转录病毒同源的DNA序列[1]，约占人类基因组的8%[2]。近年来很多研究表明，HERVs基因的活化与多种疾病相关[3-4]，包括与白血病[5]、乳腺癌[6]、1型糖尿病[7-8]等。本实验通过分离人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），选择HERV-K基因p1442-1888片段，构建pGEM-T载体，为后续实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验对象与主要试剂

健康者血液由志愿者提供。主要试剂包括：淋巴细胞分离液（灏洋华科），总RNA提取试剂盒（天根公司），逆转录试剂盒(Thermo公司)，凝胶回收试剂盒（QIAGEN公司），PCR Mix（Thermo公司），pGEM®-T克隆试剂盒(Promega公司)，EcoRI(Thermo公司)，质粒小提试剂盒（AXYGEN公司），异丙醇，感受态细菌（DH5α），LB培养基等。

1.2 引物设计与合成

引物依据美国国立卫生研究所基因及染色体基因组数据库提供HERV-K序列设计并合成。引物序列上游：5'-ATGAAAACGCCAATCCTGAG-3'；下游：5'-CAAATGGCTGAATTGGGAAT-3'。预期扩增片段大小为446 bp。

1.3 实验方法

1.3.1 分离PBMC

用含肝素采集管采集全血5 mL，200 r/min离心10 min，分离最上层血清。用等体积的PBS替代吸取的血清，转移至50 mL离心管，从底部缓慢加入15 mL淋巴细胞分离液。800 r/min离心20 min后将中间层白色絮状物吸入一个新的50 mL离心管，加入PBS至50 mL刻度线。250 r/min离心10 min，弃上清。重新用30 mL PBS重悬细胞，细胞计数后，250 r/min离心10 min。

1.3.2 提总RNA并逆转录

按总RNA提取试剂盒要求进行总RNA提取。随后进行逆转录，在12 μL反应体系中加入Random Hexamer primer 1μL，总 RNA 0.1 ～ 5 μg，Nuclease-free纯水至12 μL，轻柔混匀，65 ℃水浴5 min。冰上静置后，加入 5 × Reaction Buffer 4 μL，Ribolock RNase Inhibitor 1 μL，10 mM dNTP Mix 2 μL，ReverAid M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL，共 20 μL反应体系。置于PCR仪中进行逆转录反应：42℃60 min；70℃酶失活5 min，最后逆转录产物于-20℃保存。

1.3.3 PCR扩增

在20 μL反应体积中加入2×PCR Master Mix Green 18 μL，上下游引物各0.5 μL，模板 1 μL。 上述反应体系混匀后放入PCR扩增仪中进行扩增。PCR反应条件：94℃5 min，1个循环；94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，12个循环；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72℃ 45 s，25个循环；72℃延伸10 min。

1.3.4 凝胶DNA提取

PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切取DNA片段，放于1.5 mL离心管中称量后，加入3倍体积Buffer QG。50℃水浴10 min，检查其颜色为黄色后加入1倍体积异丙醇混匀并移入2 mL吸附柱内。17 900 r/min离心1 min，弃收集液。加500 μL Buffer QG于吸附柱内，17 900 r/min离心1 min，弃收集液。加750 μL Buffer PE于吸附柱内，17 900 r/min离心1 min，弃收集液。将吸附柱放入新的1.5 ml收集管内，加50 μL Buffer EB，放置1 min，17 900 r/min离心1 min，弃吸附柱。收集的液体即为提取的DNA溶液。提取DNA溶液通过光密度分析仪测定其浓度及OD值。

1.3.5 TA克隆

在10 μL反应体系中加入2×Rapid Ligation Buffer 5 μL，pGEM-T Easy Vector 1 μL，PCR 产物 3 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，混匀后室温放置1 h，4 ℃过夜，构建HERV-K基因p1442-1888片段pGEM-T载体。构建完成的T载体2 μL与感受态细菌DH5α混匀，冰上放置30 min，42℃水浴90 s，冰浴2 min。加250 μL LB液体培养基，于37℃培养60 min(200 r/min)。将已转化的感受态细胞涂在培养皿（含有100 μg/mL的Ampicillin）中，倒置平皿，37 ℃培养过夜(12～16 h)，出现菌落。蓝白斑筛选,挑取白色阳性单个菌落，加入到3 mL LB（含Ampicillin）液体培养基中，37℃培养过夜。菌液质粒小提试剂盒提取质粒。

1.3.6 重组质粒酶切和PCR鉴定

在10 μL反应体系中加入EcoRI 1 μL，10 × buffer EcoRI 1 μL，提取质粒 8 μL。将上述反应体系混匀后放于37℃水浴进行酶切4 h，琼脂糖凝胶电泳。阳性质粒酶切后生成500 bp左右条带。PCR扩增用于鉴定是否为阳性质粒（方法同前）。

2 结果

2.1 PBMC细胞计数

健康者5 mL血样可获得的白细胞总数为8×106。

2.2 PCR凝胶电泳结果

依据引物设计，PCR目标产物是分析HERV-K gag基因，序列长度446 bp。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示，在250～500 bp之间可见一条特异扩增带，片段大小符合预期值（图1）。250 bp下方条带为引物二聚体，不影响后期实验。

图1 PBMC cDNA PCR凝胶电泳

2.3 重组质粒的鉴定结果

HERV-K gag基因成功插入载体，并转染成功的菌落为白色；没有基因插入但生成蓝色菌落的克隆为假阳性（图2A）。挑取单个白色菌落扩增后，质粒小提，并通过酶切和PCR验证。图2B显示，经EcoRI酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳显示质粒酶切片段大小在400～500 bp之间，与预期基因片段大小一致。图2C显示，以重组质粒为模版，经PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物在400 bp处，符合预期扩增片段（446 bp）。

图2 重组质粒的鉴定

3 讨 论

HERV为古老的逆转录病毒残余物，这类病毒是在数百万年前整合到人类基因组中，并以孟德尔方式遗传至今[3,9-10]。由于逆转录病毒原始的分子特性，HERV可以通过逆转录和重组进行基因内的传播，因而创造出多种HERV基因[11-12]。长期的进化使HERV序列发生了大量的突变，导致其毒力丧失[13-15]。但研究表明，人类疾病与HERV相关，尤其是一些多因素疾病及与免疫功能失调相关的疾病，例如多发性硬化，1型糖尿病，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等。

目前已经发现的HERV家族有31个，HERV-K家族因有完整的gag、env、pol等病毒基因的开放阅读框架（open reading frames，ORFs）和相应的逆转录活性，而具有潜在的生物学功能和致病性[16]。其中gag基因编码病毒的核心蛋白，具有调节细胞的跨膜转运，直接装配和促进病毒粒子萌芽的功能［5,17］。在NOD小鼠中的研究表明，胰岛来源的间充质干细胞表达HERV-K gag基因，提示HERV基因的异常活化可能是引发Ⅰ型糖尿病自身免疫反应的原因[18]。本实验以健康人外周血白细胞作为研究对象，利用TA克隆技术成功构建pGEM-HERV-K gag质粒，通过质粒测序进行gag基因的鉴定和比对，以此鉴别特异的HERV-K家族成员。

4 结 论

重组质粒pGEM-HERV-K gag的构建，可用于比较患者和健康人群是否携带或表达不同的HERV-K成员，为研究人类内源性逆转录病毒（HERV-K）gag基因序列与1型糖尿病病的关系，寻找疾病诊断和治疗的新靶向奠定基础。