HPLC-ELSD法区分小儿氨酚黄那敏颗粒中体外培育牛黄和人工牛黄

程岁寒 张双庆 马 灿 张 彦

(1. 安琪酵母股份有限公司 湖北省酵母功能重点实验室， 湖北 宜昌 443003； 2. 三峡大学 生物与制药学院， 湖北 宜昌 443002；3. 中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京 100050)

牛黄(Bovis calculus)是脊索动物门哺乳纲牛科动物牛(Bos taurus domesticus Gmelin)肝脏的胆结石，始载于《神农本草经》，具有一定的镇静作用、明显的抗惊厥作用和解热作用，主治咽喉肿痛，口舌生疮，痈疽疔毒[1]．牛黄是临床急重病症常用药，也是配制中成药的重要原料，但是天然牛黄稀少难得，远远不能满足含牛黄制剂的药品需求．为了解决天然牛黄稀缺的状况，国家食品药品监督管理局陆续批准3种牛黄代用品：人工牛黄、培植牛黄和体外培育牛黄．

《中国药典》2015版规定，天然牛黄中按干燥品计算，含胆红素不得少于25.0%，含胆酸不得少于4.0%[2]70．人工牛黄由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成，含胆红素不得少于0.63%，含胆酸不得少于13%[2-3]．培植牛黄是利用活牛体，以外科手术的方法在牛的胆囊内插入致黄因子，使之生成牛黄[4-5]．体外培育牛黄以牛科动物牛的新鲜胆汁作母液，加入去氧胆酸、胆酸、复合胆红素钙等制成．《中国药典》2015版规定，体外培育牛黄中按干燥品计算，含胆红素不得少于35.0%，含胆酸不得少于6.0%[2]．由于牛黄用途广泛，但来源少、价格昂贵，故有时以人工牛黄或体外培育牛黄作代用品，但由于牛黄与其替代品的性状特征极为相似，价格又相差较大，市场上用其他牛黄掺伪品时有出现，故牛黄的真伪、质量应受到认真重视．如何鉴别牛黄与其替代品仅见少量报道[6]．

小儿氨酚黄那敏颗粒是由马来酸氯苯那敏(Chlorphenamine maleate， CM)、对乙酰氨基酚(Paracetamol， PT)及人工牛黄制成的抗感冒复方制剂[6]，市售小儿氨酚黄那敏颗粒大多使用人工牛黄，只有三家药厂采用体外培育牛黄．对药品小儿氨酚黄那敏颗粒中体外培育牛黄和人工牛黄的鉴别较少，仅见张轶华等[7]通过检测胆红素含量和薄层色谱法鉴别猪去氧胆酸(HA)的方法进行鉴别．体外培育牛黄不含HA，是区别体外培育牛黄和人工牛黄的依据之一，为了更准确鉴别体外培育牛黄和人工牛黄以及含牛黄的药品小儿氨酚黄那敏颗粒中牛黄种类，本文采用高效液相-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)法检测HA．该方法简便，准确，灵敏度高，重现性好．

1 仪器与试药

Chromaster高效液相色谱仪(chromaster 5310柱温箱，5210自动进样器，5110泵，配有Clarity软件，日本日立公司)；电子天平(XS205 1127423589梅特勒-托利多)；超声处理器(HU010260B，田间恒奥科技发展有限公司)；Alltech ELSD 6000型蒸发散射光检测器(美国奥泰公司)．

乙腈、甲醇、甲酸为色谱级；HA标准品购自中国食品药品检定研究院；安琪康普力星小儿氨酚黄那敏颗粒(安琪酵母股份有限公司，规格为6 g，每包含PT 0.125 g、CM 0.5 mg、体外培育牛黄5 mg)；三九小儿氨酚黄那敏颗粒剂(三九医药股份有限公司，规格为6 g，每包含PT 0.125 g、CM 0.5 mg、人工牛黄5 mg)．

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：岛津Intersil ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，4.6 μm)；流动相：0.5%甲酸∶乙腈=62∶38；柱温：40℃．流速：1.0 mL/min，进样量：20 μL．ELSD漂移管温度110℃，载气为高纯氮气，流量：2.8 L/min．

2.2 对照溶液的制备

HA对照品溶液的制备：精密称取HA对照品约10 mg置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得浓度为1 mg/mL HA对照品溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪．HA色谱峰保留时间为19.43 min．

1. HA， 1 mg/mL图1 HA对照品溶液色谱图

2.3 检测限

将1 mg/mL HA对照品液逐级稀释，进样，信噪比3倍值作为HA的检测限．本法HA的检测限为2 μg(质量浓度0.1 mg/mL)．

1. HA，0.1 mg/mL图2 HA检测限色谱图

2.4 体外培育牛黄和人工牛黄的鉴别

分别取体外培育牛黄和人工牛黄，各精密称取约25 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，超声10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪．体外培育牛黄和人工牛黄色谱图见图3，人工牛黄在19.43 min出现HA色谱峰，而体外培育牛黄却没有检出HA．

A. 人工牛黄，1 mg/mL; B. 体外培育牛黄，1 mg/mL； 1. HA图3 人工牛黄与体外培育牛黄色谱图

2.5 小儿氨酚黄那敏样品的检测

分别取含体外培育牛黄(安琪康普力星)和人工牛黄(999)的小儿氨酚黄那敏颗粒各10袋，研细，精密称取约12 g(约相当于牛黄10 mg)，置25 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，超声20 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取5 mL续滤液置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得约含牛黄0.2 mg/mL的样品溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪．样品色谱图见图4，安琪康普力星小儿氨酚黄那敏颗粒中使用体外培育牛黄，并不含HA，而999小儿氨酚黄那敏颗粒中使用人工牛黄，检出HA．

A.含人工牛黄颗粒(999)； B.含体外培育牛黄颗粒(安琪)； 1.HA图4 小儿氨酚黄那敏颗粒样品色谱图

3 讨 论

目前国内含有牛黄成分的中成药共有500余种，其中多数中成药中的牛黄成分是价格低廉、药效较差的人工牛黄，国家食品药品监督管理局于2004年发布了关于牛黄及其代用品使用问题的通知(国食药监注[2004]21号)，规定对于国家药品标准处方中含牛黄的临床急重病症用药品种(42种)和国家药品监督管理部门批准的含牛黄的新药，可以将处方中的牛黄以培植牛黄、体外培育牛黄替代牛黄等量投料使用，但不得以人工牛黄替代，其他含牛黄的品种可使用代用品．因此快速鉴别人工牛黄和体外培育牛黄极为重要，吕浩然等[8]通过性状、显微及薄层色谱的手段鉴别人工牛黄和体外培育牛黄．性状鉴别虽简单易行，但需要鉴别者具有丰富的中药材知识和实际工作经验．而薄层色谱法在鉴别HA虽具有快速直观的优点，但是同时具有灵敏度低的缺点，小儿氨酚黄那敏颗粒及其他药品中牛黄含量仅为几个mg，其中HA含量会更低，很难鉴别出来．本法通过HPLC-ELSD法可在含人工牛黄(0.2 mg/mL)的小儿氨酚黄那敏颗粒样品溶液中准确检出HA，从而鉴别人工牛黄和体外培育牛黄，具有灵敏度高的特点．