微生物厌氧发酵处理对张杂谷谷草分子结构特征和营养成分的影响

田雨佳，郭 鹏，李胜利，张学炜*，郭 爽

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 北京好友巡天生物技术有限责任公司，北京100081；3.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；4. 天津市奶业发展服务中心，天津 300210）

“张杂谷”是我国自主培育的具有高产、节水、耐干旱、耐贫瘠、抗倒伏等特点的禾本科粮食作物[1]。张杂谷谷草营养价值较高，用其代替奶牛及羊日粮中部分粗饲料具有很好的饲喂效果[2-3]，但张杂谷谷草的营养价值仍可提升。常见的提升粗饲料营养价值方法有物理法、化学法和生物法[4]，其中，微生物发酵处理是目前最为常见的方法之一。微生物处理秸秆的主要优势是微生物产生的特殊酶可以破坏秸秆的细胞壁，可降解部分连接紧密的木质素形成大量的空洞，使粗饲料中的纤维更容易与动物体内的酶结合而被消化[5]。Yu等[6]报道，不同饲料的蛋白质和碳水化合物分子结构特征不同会影响饲料在反刍动物瘤胃中与微生物酶的结合和降解，进而影响饲料的营养价值。近几年，光谱技术的进步使得分子结构特征的测定得以实现。傅里叶变换红外光谱（DRⅠFT或ATR-FT/ⅠR）技术是一种无损非接触的分析技术，可以获得饲料的蛋白质及碳水化合物分子结构特征图谱，进而揭示差异或改变。目前，科学家们已利用光谱技术研究了苜蓿、饼粕类、DDGS等饲草和饲料的蛋白质及碳水化合物结构特征以及与常规营养成分的相关性，并建立了较为成熟的分析方法[7-8]。蛋白质基线在ca.1 718～1 482 cm-1、碳水化合物基线在ca.1 200～800 cm-1的傅里叶变换红外光谱可呈现蛋白质及碳水化合物的结构图谱[9]。

本试验利用傅里叶变换红外光谱（ATR-FT/ⅠR）扫描技术，测定微生物发酵处理张杂谷谷草与普通张杂谷谷草的分子结构特征，分析常规营养指标与分子结构的相关性，从分子水平揭示微生物厌氧发酵对张杂谷谷草营养的影响及引起变化的根本原因。

1 材料与方法

1.1 试验样品 选择河北省张家口地区的3个地块，每个地块采集抽穗期张杂谷谷草收割后的样品10 kg，一半晒干制成干草，粉碎后过40目分析筛保存备用，另一半切短成5～8 cm，将复合菌种（布氏乳杆菌、黑曲霉菌、产朊假丝酵母菌、里氏木酶菌等）制成的发酵剂于25～35℃的生长因子营养液中活化0.5～1.5 h，选择活化后2 h活菌数达到20亿/mL的细菌液（发酵剂来源于北京好友巡天生物技术有限责任公司），喷洒到张杂谷谷草上，在环境温度20～35℃、湿度40%～60%条件下，将5 kg张杂谷谷草放置于聚乙烯厌氧发酵罐（10 L /个）中，以每个地块设置为1个重复（n=3），厌氧发酵7 d制成发酵张杂谷谷草，然后风干、粉碎处理，并过40目分析筛保存备用。即微生物厌氧发酵张杂谷谷草3个重复，普通张杂谷谷草3个重复。

1.2 常规营养成分测定 根据AOAC标准（1990）[10]测定发酵处理与普通张杂谷谷草粗蛋白质（CP）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）含量，采用硫酸-蒽酮比色法[11]测定水溶性碳水化合物（WSC）含量，每个重复3个平行。

1.3 分子结构分析

1.3.1 图谱采集 将样品进一步粉碎过0.25 mm分析筛，启动Lambda ATR-FT/ⅠR（天津港东科技有限公司），选择扫描波长范围为ca. 4 000～800 cm-1，扫描次数64次，每个样品平行扫描10次，同时采集背景图谱以扣除环境的影响。将所采集图谱由GⅠF格式转化为CSV格式，等待分析。

1.3.2 分子结构图谱分析 利用OMNⅠC 7.5图谱分析软件，逐步解析厌氧处理前与处理后张杂谷谷草所采集的图谱。其中，蛋白质分子结构特征参数包括酰胺Ⅰ区、酰胺 ⅠⅠ区的峰高（A_Ⅰ_H、A_Ⅱ_H）及峰面积（A_Ⅰ_A、A_Ⅱ_A）、酰胺Ⅰ区与酰胺ⅠⅠ区的峰面积总和（S_Ⅰ_Ⅱ_A）、酰胺Ⅰ区与酰胺ⅠⅠ区的面积（R_Ⅰ_Ⅱ_A）及峰高度比值（R_Ⅰ_Ⅱ_H）；总碳水化合物分子结构特征参数包括总碳水化合物吸收峰中3个小峰的峰高、峰面积以及总碳水化合物吸收峰总面积。

1.4 分子结构与营养成分相关性分析 分析厌氧处理前与处理后张杂谷谷草蛋白质结构特征参数与CP的相关性；碳水化合物分子结构特征参数与NDF、ADF和WSC的相关性。

1.5 统计分析 CP、NDF、ADF、WSC含量与分子结构单变量图谱数据应用SAS 9.2进行单因素Duncan's方差分析，利用CORR程序中Spearman进行相关性分析。以P＜0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 发酵张杂谷谷草与普通张杂谷谷草常规营养成分由表1可见，发酵张杂谷谷草WSC含量显著高于普通张杂谷谷草（P＜0.05），发酵处理与未处理张杂谷谷草的CP、NDF及ADF无显著差异（P＞0.05）。

表1 基础饲粮组成及营养成分（风干基础）

2.2 发酵张杂谷谷草与普通张杂谷谷草的蛋白质分子结构分析 由表2可见，发酵张杂谷谷草的（S_Ⅰ_Ⅱ_A）、酰胺Ⅰ和ⅠⅠ的峰高比值（R_Ⅰ_Ⅱ_H）显著低于普通张杂谷谷草（P＜0.05），（A_Ⅱ_H）则显著高于普通张杂谷谷草（P＜0.05）；发酵与普通张杂谷谷草的其他蛋白质分子结构特征指标无显著差异（P＞0.05）。

2.3 发酵张杂谷谷草与张杂谷谷草的碳水化合物分子结构分析 由表3可见，发酵张杂谷谷草的总碳水化合物第一、二、三亚峰峰高（TCHO_1_H、TCHO_2_H、TCHO_3_H） 和 峰 面 积 (TCHO_1_A、TCHO_2_A、TCHO_3_A）以及总碳水化合物峰面积(TCHO_A)均显著高于普通张杂谷谷草（P＜0.05），表明微生物发酵可提高总碳水化合物含量。

表2 发酵张杂谷谷草与普通张杂谷谷草的蛋白质分子结构分析（n=3）

2.4 常规营养成分与分子结构特征参数的相关性

2.4.1 CP与蛋白质分子结构特征参数的相关性 由表4可见，CP与蛋白质分子结构的A_Ⅰ_H呈显著的正相关（P＜0.05），相关系数达到0.67。CP与其他蛋白质分子结构相关性不显著（P＞0.05）。

2.4.2 NDF、ADF、WSC与碳水化合物分子结构的相关性 表5显示，WSC含量与TCHO_1_A呈显著正相关（r=0.61，P＜0.05），与TCHO_2_H呈显著正相关（r=0.61，P＜0.05）。NDF、ADF与碳水化合物分子结构特征参数之间无显著相关关系。

3 讨 论

3.1 微生物厌氧发酵处理对张杂谷谷草CP含量和蛋白质分子结构特征的影响 在生产中，常用CP含量判断饲料的蛋白质营养价值，但即使2种饲料CP含量相近，蛋白质内部分子结构也不尽一致[12]。本研究结果显示，CP与蛋白质分子结构的A_Ⅰ_H呈显著正相关，但发酵张杂谷谷草与普通张杂谷谷草的A_Ⅰ_H无显著差异，进一步证实了蛋白质分子结构差异不会直接反映在CP含量上。

本试验中，发酵张杂谷谷草与普通张杂谷谷草CP含量无显著差异，但发酵张杂谷谷草的A_Ⅰ_A与A_ⅠⅠ_A 之和、R_Ⅰ_ⅠⅠ_H 显著低于普通张杂谷谷草，A_ⅠⅠ_H则显著高于普通张杂谷谷草。说明发酵张杂谷谷草与普通张杂谷谷草的蛋白质分子有差异，不同之处主要在酰胺ⅠⅠ区。研究表明，酰胺Ⅰ区主要由C=O伸展振动和少量的C-N伸展振动构成；酰胺ⅠⅠ区主要由N-H 弯曲、C-N 伸展和少量的C=O伸展、C-C伸展和N-C伸展组成[13]。影响因素包括饲料品质、转基因处理，压榨、发酵等加工方法，蛋白质酰胺ⅠⅠ区的差异会影响动物对蛋白质的利用和消化[14]。

蛋白质分子光谱结构特性可能会影响蛋白质在瘤胃内的代谢特性。不同饲料种类、不同加工处理后瘤胃降解参数与蛋白质分子结构存在差异[15]。结合本试验的张杂谷谷草营养成分和蛋白质分子结构结果，说明发酵处理与未处理张杂谷谷草可为动物提供相似的CP水平，但由于二者酰胺ⅠⅠ区显著不同，说明蛋白质组分能够被动物利用的程度可能也会不同，有待于后续通过动物消化试验进行验证。

表3 发酵张杂谷谷草与普通张杂谷谷草的碳水化合物分子结构分析

表4 发酵张杂谷谷草与普通张杂谷谷草CP与蛋白质分子结构特征参数的相关性

表5 发酵张杂谷谷草与普通张杂谷谷草NDF、ADF、WSC与碳水化合物分子结构的相关性

3.2 微生物厌氧发酵处理对张杂谷谷草碳水化合物成分及其分子结构特征的影响 饲料碳水化合物包括结构性碳水化合物和非结构性碳水化合物。本研究结果发现，发酵张杂谷谷草NDF及ADF等结构性碳水化合物含量与普通张杂谷谷草差异不显著，可能是发酵时间太短导致；但非结构性碳水化合物WSC含量显著高于普通张杂谷谷草；WSC含量与TCHO_1_A、TCHO_2_A均呈正相关。Zhang等[16]研究发现，饲料淀粉和NFC含量与总碳水化合物呈正相关，这与本研究结果相似，说明TCHO_1_H、TCHO_2_H越高，非结构性碳水化合物含量越高。另外，发酵张杂谷谷草TCHO_1_A显著高于普通张杂谷谷草（0.59 vs. 0.22）；发酵张杂谷谷草的TCHO_2_A也显著高于普通张杂谷谷草组（2.85 vs.0.66），可能是造成发酵张杂谷谷草WSC含量显著高于普通张杂谷谷草的主要原因。究其深层次原因，可能是复合细菌产生的特殊酶可以破坏谷草秆的细胞壁，进而释放张杂谷谷草茎秆内部的营养组分。

4 结 论

微生物厌氧发酵处理对张杂谷谷草 CP含量无显著影响，但会影响蛋白质酰胺ⅠⅠ区分子结构。微生物厌氧发酵处理张杂谷谷草会改变总碳水化合物的分子结构，显著提高各特征参数的峰值和峰面积，进而提高WSC含量和碳水化合物的潜在利用率。