薄壳山核桃种仁中酚类成分含量和抗氧化能力差异分析及优株筛选

罗会婷， 许梦洋， 贾晓东，2，①， 翟 敏， 李永荣， 宣继萍， 张计育， 郭忠仁，①

〔1. 江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)， 江苏 南京 210014； 2. 南京农业大学园艺学院， 江苏 南京 210095； 3. 南京绿宙薄壳山核桃科技有限公司， 江苏 南京 210007〕

薄壳山核桃〔Caryaillinoinensis(Wangenh.) K. Koch〕又名美国山核桃、长山核桃等，起源于美国和墨西哥交界处的河谷地带[1]。薄壳山核桃作为商品化作物仅百余年，但其引入中国的时间已有110多年[2]。迄今为止，中国已有20多个省(自治区、直辖市)引种并种植该树种。薄壳山核桃种仁营养丰富，尤其富含油脂及人体所需的多种营养成分，既是著名的干果树种，也是重要的木本油料树种。

酚类成分广泛存在于植物体中，主要包括黄酮类和缩合单宁类[3]。对于薄壳山核桃中酚类成分的研究始于20世纪。早在20世纪80年代初，Senter等[4]利用气相色谱法从薄壳山核桃品种‘Stuart’和‘Schley’的种仁中检测出没食子酸及水杨酸衍生物；随着检测仪器和实验方法的提升，人们陆续在薄壳山核桃的种仁或壳中发现儿茶素、表儿茶素和鞣花酸等酚类成分[5-8]。Wu等[9]对比了薄壳山核桃与多种蔬菜和坚果，发现薄壳山核桃的总酚含量最高且抗氧化能力最强。相关研究结果[10-13]还表明：酚类成分能够降低多种慢性疾病的发病率，如阿尔茨海默病、帕金森综合征、癌症和变性疾病等。

传统的薄壳山核桃育种目的局限于提高产量、增强抗性和完善果形等方面，但以提升营养水平为目的选育工作目前尚未受到重视。作者在前期主要针对薄壳山核桃的果实性状和种仁脂肪酸含量开展了部分选育工作[14]，在此基础上，作者依据总黄酮、缩合单宁、总酚、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和鞣花酸含量及总酚提取物对DPPH·和ABTS+·清除能力10个指标，对南京地区76株薄壳山核桃单株种仁中酚类成分含量及抗氧化能力进行了比较分析，以期筛选出高酚类含量及高抗氧化能力的薄壳山核桃优良单株，为薄壳山核桃优良品种选育提供基础研究数据。

1 材料和方法

1.1 材料

于2015年10月至11月在江苏省南京市的南京中山植物园以及雨花台和明孝陵景区采收薄壳山核桃实生单株的成熟果实。选择树龄50～60 a、树体强健(株高20 m以上、胸径50 cm以上)且少病虫害的76株样株进行采种；采用升降机辅助、人工敲落的方法从树体中部的各个方位采集果实，每株采集约1 kg，将各样株的果实分为3个生物学重复；同时，按1至76顺序对采种样株和果实样本同步编号，便于翌年持续观测和采种。

主要仪器包括Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、UV-5100型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)、EFAA-DC12氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司)和YRE-2000E旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司)。

主要试剂：没食子酸(GA，纯度大于等于98%)、儿茶素(CE，纯度大于等于98%)、表儿茶素(ECE，纯度大于等于98%)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，纯度大于等于98%)和鞣花酸(EAE，纯度大于等于98%)5种酚类化合物标准品均购自南京春秋生物工程有限公司；香草醛(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；福林酚试剂购自美国Sigma-Aldrich公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；2，2′-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐购自美国Sigma-Aldrich公司；6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸(trolox)购自东京化成工业株式会社；甲醇(色谱纯)、丙酮(分析纯)和乙腈(色谱纯)购自南京寿德试剂器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脱脂和总酚提取 人工去除果实外壳，取种仁供试。将种仁置于60 ℃烘箱中烘干至恒质量，采用索氏提取法[15]提取油脂；脱脂后的种仁于50 ℃旋转蒸干，碾磨成粉末后用锡箔纸密封包装，于-20 ℃保存、备用。

总酚提取参考文献[6，8]的方法并稍加修改。称取约1.000 g脱脂种仁粉末，加入20 mL体积分数80%丙酮作为提取溶剂，浸提12 h，超声(功率100 W，室温)提取2 h；过滤，残渣加入20 mL体积分数80%丙酮超声提取30 min；过滤，合并2次滤液于50 ℃水浴，氮气吹干；加入10 mL甲醇溶解残渣，于-20 ℃保存、备用。

1.2.2 总黄酮含量测定 总黄酮含量测定参考文献[16]的方法并稍加修改。准确称取0.100 g儿茶素，用甲醇定容至25 mL，得到4 000 μg·mL-1儿茶素标准品母液；用甲醇逐级稀释至3 600、2 800、2 400、2 000、1 600、1 200、800和400 μg·mL-1。测定吸光值，并以儿茶素质量浓度为自变量(x)、吸光值为因变量(y)绘制标准曲线。儿茶素标准曲线为y=0.000 5x+0.013 8(R2=0.999 1)。

根据上述儿茶素标准曲线计算各样品的总黄酮含量；结果以1 g鲜种仁中含有的儿茶素等价物的质量计。

1.2.3 缩合单宁含量测定 缩合单宁含量测定参考文献[6]的方法并稍加修改。准确称取0.200 g儿茶素，用甲醇定容至5 mL，得到40 mg·mL-1儿茶素标准品母液；用甲醇逐级稀释至40、36、32、28、24、20、16、8和4 mg·mL-1。测定吸光值，并以儿茶素质量浓度为自变量(x)、吸光值为因变量(y)绘制标准曲线。儿茶素标准曲线为y=0.000 05x+0.294 40(R2=0.999 00)。

根据上述儿茶素标准曲线计算各样品的缩合单宁含量；结果以1 g鲜种仁中含有的儿茶素等价物的质量计。

1.2.4 总酚含量测定 总酚含量测定参照文献[6]采用福林酚试剂法。准确称取40 mg鞣花酸，用甲醇定容至10 mL，得到4 000 μg·mL-1鞣花酸标准品母液；用甲醇逐级稀释至3 600、3 200、2 800、2 400、2 000和1 600 μg·mL-1。测定吸光值，并以鞣花酸质量浓度为自变量(x)、吸光值为因变量(y)绘制标准曲线。鞣花酸标准曲线为y=0.000 1x+0.122 7(R2=0.999 9)。

根据上述鞣花酸标准曲线计算各样品的总酚含量，结果以1 g鲜种仁中含有的鞣花酸等价物的质量计。

1.2.5 5种酚类化合物含量测定 参照文献[17]设置高效液相色谱(HPLC)条件：Gemini色谱柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；采用A和B双泵系统，流速1.0 mL·min-1；流动相A为体积分数2%乙酸，流动相B为体积分数100%乙腈；洗脱流程为5%～37%B(0～40 min)，37%～5%B(40～41 min)，5%B(41～50 min)；柱温35 ℃，检测波长250 nm，进样量10 μL。每个样品测定3次。

准确称取没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和鞣花酸各1 mg，分别用甲醇定容至10 mL，得到0.1 mg·mL-1相应的标准品母液；分别用甲醇逐级稀释至0.050 0、0.025 0、0.016 6、0.012 5和0.010 0 mg·mL-1，按上述色谱条件进样测定。以各标准品的质量浓度为自变量(x)、峰面积为因变量(y)分别绘制标准曲线。没食子酸标准曲线为y= 1 274 302.173 9x+ 9.200 7 (R2=0.999 9)；儿茶素标准曲线为y=145 650.000 0x+1.500 0(R2=0.999 7)；表儿茶素标准曲线为y=131 850.000 0x+4.090 0(R2=0.998 4)；表没食子儿茶素没食子酸酯标准曲线为y=537 500.000 0x+7.750 0(R2=0.997 9)；鞣花酸标准曲线为y=9 766 750.000 0x+107.650 0(R2=0.999 5)。

按照上述色谱条件对样品总酚提取液进样测定，并根据上述各标准品的标准曲线分别计算各样品中没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和鞣花酸的含量，结果以1 g鲜种仁中含有的各成分的质量计。

1.2.6 DPPH·和ABTS+·清除能力测定 总酚提取液对DPPH·清除能力的测定参考文献[18]的方法并稍加修改；总酚提取液对ABTS+·清除能力的测定参考文献[17]的方法并稍加修改。准确称取0.100 g trolox，用甲醇定容至25 mL，得到4 000 μg·mL-1trolox标准品母液，再用甲醇逐级稀释至2 000、1 000、500、250和125 μg·mL-1。测定吸光值，并以trolox标准品的质量浓度为自变量(x)、吸光值为因变量(y)分别绘制标准曲线。DPPH·清除能力标准曲线为y=-0.000 2x+0.937 7(R2=0.999 7)；ABTS+·清除能力标准曲线为y=-0.001 4x+1.667 2(R2=0.999 8)。

根据上述trolox标准品曲线计算各样品对DPPH·和ABTS+·清除能力，结果以1 g鲜种仁中含有的trolox等价物的量计。

1.3 数据处理和分析

采用EXCEL 2007和SPSS 19.0统计分析软件进行数据处理和分析。

2 结果和分析

2.1 酚类成分含量及抗氧化能力差异分析

对供试76株薄壳山核桃单株种仁中酚类成分含量及总酚提取物抗氧化能力的差异进行分析，结果见表1。

表176株薄壳山核桃单株种仁中酚类成分含量及总酚提取物对DPPH·和ABTS+·清除能力的统计分析

Table1StatisticalanalysisonphenolicscontentandscavengingabilitiesoftotalphenolicextractstoDPPH·andABTS+·fromkernelof76individualsofCaryaillinoinensis(Wangenh.)K.Koch

统计量1)Statistic1)含量/(mg·g-1) Content清除能力/(μmol·g-1)Scavenging ability总黄酮Total flavonoids缩合单宁Condensed tannins总酚Total phenolics没食子酸Gallic acid儿茶素(+)-catechin表儿茶素 (-)-epicatechinEGCG2)鞣花酸Ellagic acidDPPH·ABTS+·X3.0818.6511.730.091.390.900.531.03249.61207.77Max7.0449.1626.660.283.224.141.462.69618.04382.99Min1.456.785.410.020.330.010.020.3941.0963.32SD1.057.483.720.040.800.810.270.53110.1872.30CV/%34.2240.1131.7548.9957.7790.2650.7251.1844.1434.80

2)EGCG： 表没食子儿茶素没食子酸酯 (-)-epigallocatechin gallate.

由表1可见：供试76株单株种仁中总黄酮含量为1.45～7.04 mg·g-1，平均值为3.08 mg·g-1；缩合单宁含量为6.78～49.16 mg·g-1，平均值为18.65 mg·g-1；总酚含量为5.41～26.66 mg·g-1，平均值为11.73 mg·g-1。5种酚类化合物中，儿茶素含量最高，平均值为1.39 mg·g-1；鞣花酸含量次之，平均值为1.03 mg·g-1；没食子酸含量最低，平均值为0.09 mg·g-1。总酚提取物对DPPH·清除能力为41.09～618.04 μmol·g-1，平均值为249.61 μmol·g-1；而总酚提取物对ABTS+·清除能力为63.32～382.99 μmol·g-1，平均值为207.77 μmol·g-1。

由表1还可见：供试76株单株种仁中酚类成分含量及总酚提取物的抗氧化能力差异明显，变异系数达到31.75%～90.26%。总黄酮、缩合单宁和总酚含量的变异系数分别为34.22%、40.11%和31.75%；没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和鞣花酸5种酚类化合物含量的变异系数均在48%以上，其中，表儿茶素含量的变异系数高达90.26%。总酚提取物对DPPH·和ABTS+·清除能力的变异系数则分别为44.14%和34.80%。

2.2 高酚类含量和高抗氧化能力的优株筛选

依据种仁中总黄酮、缩合单宁、总酚、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和鞣花酸含量以及总酚提取物对DPPH·和ABTS+·清除能力10个指标，从供试76株薄壳山核桃单株中分别筛选出排名前10的单株，结果见表2。

由表2可见：供试76株单株中，70号、30号、23号和29号单株种仁中总黄酮、缩合单宁和总酚含量均排名前10。70号单株种仁中总黄酮、缩合单宁和总酚含量均排名第1，分别为7.04、49.16和26.66 mg·g-1，均与其他单株有显著(P<0.05)差异；30号单株种仁中总黄酮和总酚含量排名第2，其缩合单宁含量排名第3，分别为6.22、22.31和34.15 mg·g-1。此外，23号单株种仁中总黄酮、缩合单宁和总酚含量分别为5.85、31.10和21.71 mg·g-1，分别排名第3、第5和第3；29号单株种仁中总黄酮、缩合单宁和总酚含量分别为4.69、31.60和17.45 mg·g-1，分别排名第5、第4和第6。此外，63号、20号和54号单株种仁中总黄酮和缩合单宁含量也均较高，均排名前10；而2号单株种仁中总黄酮和总酚含量也均排名前10，其中总酚含量仅次于70号、30号和23号。

供试76株单株中，仅18号单株种仁中没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和鞣花酸含量均排名前10，分别排名第5、第5、第10、第3和第3。没食子酸含量排名前4的单株为70号、4号、29号和30号单株；儿茶素含量排名前4的单株为66号、34号、70号和44号单株；表儿茶素含量排名前4的单株为30号、70号、23号和20号单株；表没食子儿茶素没食子酸酯含量排名前4的单株为4号、48号、18号和66号单株；鞣花酸含量排名前4的单株为30号、70号、18号和49号单株。其中，70号单株的没食子酸含量排名第1(0.99 mg·g-1)，其儿茶素、表儿茶素和鞣花酸含量也均排名前3；30号单株的表儿茶素和鞣花酸含量均排名第1，分别为14.07和9.11 mg·g-1，其没食子酸含量也较高，排名第4。另外，4号单株的表没食子儿茶素没食子酸酯含量排名第1，其没食子酸、儿茶素和鞣花酸含量也均排名前10。

排名Ranking单株编号No. of individualC1/(mg·g-1)单株编号No. of individualC2/(mg·g-1)单株编号No. of individualC3/(mg·g-1)单株编号No. of individualC4/(mg·g-1)单株编号No. of individualC5/(mg·g-1)1707.04±0.24a7049.16±0.99a7026.66±0.08a700.99±0.01a6622.27±0.42a2306.22±0.26b6334.25±1.13b3022.31±0.32b40.72±0.01b3412.26±0.32b3235.85±0.32c3034.15±0.32b2321.71±0.27b290.60±0.01bc7011.60±0.37b4105.30±0.41cd2931.60±0.95bc217.81±0.17d300.56±0.01c449.95±0.21c5294.69±0.35d2331.10±0.37c5717.81±0.08d180.55±0.01c189.35±0.25c6634.57±0.23d1030.60±1.26c2917.45±0.08d140.55±0.01c129.23±0.31c7204.35±0.25d5430.08±0.21cd2615.71±0.12e260.52±0.01c768.98±0.18cd8544.32±0.31de5929.14±0.87d1815.53±0.06e340.50±0.01cd77.89±0.20d9494.04±0.25e2029.11±1.02d5115.36±0.19e200.48±0.01cd627.82±0.19d1024.00±0.05e7227.66±0.27e2215.02±0.12e560.45±0.01d47.68±0.29d排名Ranking单株编号No. of individualC6/(mg·g-1)单株编号No. of individualC7/(mg·g-1)单株编号No. of individualC8/(mg·g-1)单株编号No. of individualSA1/(μmol·g-1)单株编号No. of individualSA2/(μmol·g-1)13014.07±0.46a45.20±0.26a309.11±0.33a70618.04±2.90a30382.99±5.85a 27012.89±0.31b484.87±0.20a707.16±0.24b62468.78±1.47b70348.03±12.31b32312.60±0.27b184.67±0.13a186.99±0.16b69468.16±1.98b20342.70±1.90bc4209.32±0.25c664.22±0.15ab496.80±0.32b63444.29±3.04c62335.95±13.17c5298.96±0.32cd193.48±0.16b46.71±0.26b56417.94±1.48d10335.64±9.23c6417.12±0.31d163.31±0.28b296.14±0.43bc72415.16±2.46d11329.18±7.20d7167.01±0.26d393.17±0.20b576.00±0.29c21410.72±3.65de46319.35±5.90e8666.01±0.19e93.09±0.21b445.80±0.17cd58387.29±1.68e34310.15±4.61f9625.13±0.19ef12.99±0.35b235.56±0.31cd54385.86±1.52e69303.32±15.93gh10184.85±0.20f332.91±0.14b75.22±0.24d34383.34±1.13e18295.61±13.07h

1)C1： 总黄酮含量 Content of total flavonoids； C2： 缩合单宁含量 Content of condensed tannins； C3： 总酚含量 Content of total phenolics； C4： 没食子酸含量Content of gallic acid； C5： 儿茶素含量Content of (+)-catechin； C6： 表儿茶素含量Content of (-)-epicatechin； C7： 表没食子儿茶素没食子酸酯含量Content of (-)-epigallocatechin gallate； C8： 鞣花酸含量Content of ellagic acid； SA1： DPPH·清除能力Scavenging ability to DPPH·； SA2： ABTS+·清除能力Scavenging ability to ABTS+·. 同列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

总酚提取物对DPPH·和ABTS+·清除能力均排名前10的单株为70号、62号、69号和34号单株。其中，70号单株的DPPH·和ABTS+·清除能力分别排名第1和第2，分别达到618.04 和348.03 μmol·g-1；62号单株的这2个抗氧化能力指标也均排名前4；30号单株的ABTS+·清除能力排名第1(382.99 μmol·g-1)，且显著高于其他单株。

总体上看，70号单株种仁中，除表没食子儿茶素没食子酸酯含量外，其他9个指标均排名前3，其中，5个指标排名第1，3个指标排名第2，1个指标排名第3，说明70号单株不论是在酚类成分含量还是抗氧化能力方面均具有明显优势，可作为高酚类含量和高抗氧化能力的双优株。若以高酚类含量作为筛选目标，则除70号单株外，30号和29号单株也有6个酚类成分含量指标排名前6，可作为高酚类含量的优选单株。若以高抗氧化能力作为筛选目标，则除70号单株外，62号、69号和34号单株的2个抗氧化能力指标均排名前10，可作为高抗氧化能力的优选单株。

2.3 果实和种仁不同性状间的相关性分析

2.3.1 种仁中酚类成分含量及总酚提取物抗氧化能力间的相关性分析 对供试76株薄壳山核桃单株种仁中酚类成分含量及总酚提取物抗氧化能力的10个指标间进行相关性分析，结果见表3。

由表3可见：供试76株单株种仁中总黄酮含量、缩合单宁含量和总酚含量三者间均呈极显著(P<0.01)正相关，其中，总酚含量与总黄酮含量的相关系数最大(0.909)，缩合单宁含量与总黄酮含量以及总酚含量与缩合单宁含量的相关系数分别为0.877和0.803；5种酚类化合物中，仅表没食子儿茶素没食子酸酯含量与其他化合物的含量呈不显著相关，其他4种酚类化合物的含量总体上均呈极显著正相关；另外，表没食子儿茶素没食子酸酯含量与总黄酮含量、缩合单宁含量和总酚含量呈不显著负相关，儿茶素含量与缩合单宁含量呈不显著正相关，其他4种酚类化合物的含量与总黄酮含量、缩合单宁含量和总酚含量呈显著(P<0.05)或极显著正相关。

总黄酮含量、缩合单宁含量、总酚含量与总酚提取物对DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力均呈极显著正相关，其中，缩合单宁含量与总酚提取物对DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力的相关系数最大，分别为0.512和0.480。5种酚类化合物中，除表没食子儿茶素没食子酸酯含量外，其他4种酚类化合物的含量与总酚提取物对DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力总体上均呈显著或极显著正相关。此外，总酚提取物对DPPH·清除能力与其对ABTS+·清除能力呈极显著正相关。

表376株薄壳山核桃单株种仁中酚类成分含量及总酚提取物抗氧化能力10个指标间的相关性分析结果1)

Table3Resultofcorrelationanalysisontenindexesofphenolicscontentandantioxidantabilityoftotalphenolicextractsfromkernelof76individualsofCaryaillinoinensis(Wangenh.)K.Koch1)

指标Index各指标间的相关系数 Correlation coefficient among each indexC1C2C3C4C5C6C7C8SA1SA2C11.000C20.877**1.000C30.909**0.803**1.000C40.661**0.621**0.630**1.000C50.233*0.1880.314**0.390**1.000C60.627**0.531**0.640**0.556**0.336**1.000C7-0.309-0.331-0.268-0.0290.165-0.0871.000C80.506**0.308**0.599**0.597**0.452**0.631**0.0721.000SA10.350**0.512**0.415**0.630**0.419**0.309**0.0310.312**1.000SA20.448**0.480**0.467**0.396**0.246*0.469**0.0380.357**0.577**1.000

1)C1： 总黄酮含量 Content of total flavonoids； C2： 缩合单宁含量 Content of condensed tannins； C3： 总酚含量 Content of total phenolics； C4： 没食子酸含量Content of gallic acid； C5： 儿茶素含量Content of (+)-catechin； C6： 表儿茶素含量Content of (-)-epicatechin； C7： 表没食子儿茶素没食子酸酯含量Content of (-)-epigallocatechin gallate； C8： 鞣花酸含量Content of ellagic acid； SA1： DPPH·清除能力Scavenging ability to DPPH·； SA2： ABTS+·清除能力Scavenging ability to ABTS+·. *：P<0.05； ** ：P<0.01.

2.3.2 果实性状与种仁生化性状间的相关性分析

结合前期工作[14]的部分数据，对供试76株薄壳山核桃单株种仁中酚类成分含量和总酚提取物抗氧化能力的10个指标与果实的8个性状指标(包括果实的坚果质量、种仁鲜质量、坚果壳厚度、坚果纵径、坚果横径、坚果果形指数、出仁率和含油率)进行相关性分析。结果见表4。

由表4可见：供试76株单株种仁的8个酚类成分含量指标与果实的8个性状指标总体上均无显著相关性，仅总黄酮含量和总酚含量与含油率呈极显著负相关；儿茶素含量和表没食子儿茶素没食子酸酯含量与坚果壳厚度呈显著正相关；表儿茶素含量与出仁率呈显著正相关。而总酚提取物的抗氧化能力2个指标中，仅总酚提取物对DPPH·清除能力与含油率呈显著正相关。

表476株薄壳山核桃单株种仁中酚类成分含量及总酚提取物抗氧化能力10个指标与果实的8个性状指标间的相关性分析结果1)

Table4Resultofcorrelationanalysisontenindexesofphenolicscontentandantioxidantabilityoftotalphenolicextractsfromkernelwitheighttraitindexesoffruitof76individualsofCaryaillinoinensis(Wangenh.)K.Koch1)

1)C1： 总黄酮含量 Content of total flavonoids； C2： 缩合单宁含量 Content of condensed tannins； C3： 总酚含量 Content of total phenolics； C4： 没食子酸含量Content of gallic acid； C5： 儿茶素含量Content of (+)-catechin； C6： 表儿茶素含量Content of (-)-epicatechin； C7： 表没食子儿茶素没食子酸酯含量Content of (-)-epigallocatechin gallate； C8： 鞣花酸含量Content of ellagic acid； SA1： DPPH·清除能力Scavenging ability to DPPH·； SA2： ABTS+·清除能力Scavenging ability to ABTS+·. W1： 坚果质量 Nut weight； W2： 种仁鲜质量Fresh weight of kernel； TS： 坚果壳厚度 Shell thickness； D1： 坚果纵径 Nut vertical diameter； D2： 坚果横径 Nut horizontal diameter； INS： 坚果果形指数 Nut shape index； R1： 出仁率 Kernel rate； R2： 含油率 Oil content. *：P<0.05； ** ：P<0.01.

3 讨论和结论

上述测定结果表明：76株薄壳山核桃单株种仁中酚类成分含量差异明显，总黄酮、缩合单宁和总酚含量的变异系数分别为34.22%、40.11%和31.75%；5种酚类化合物含量的变异系数均在48%以上，其中，不同单株间表儿茶素含量的变异系数达到90.26%。说明不同薄壳山核桃单株种仁中酚类成分含量存在较大差异，这种差异既与不同单株的生长环境和生长状况的差异有关，也与各单株的遗传特性和次生代谢途径的差异有关，是薄壳山核桃高酚类含量品种选育的基础。

薄壳山核桃种仁中酚类成分含量丰富。Sarkis等[19]的比较结果显示：薄壳山核桃种仁中的酚类成分含量显著高于榛子(CorylusheterophyllaFisch.)和向日葵(HelianthusannuusLinn.)等其他油料作物。本研究结果显示：薄壳山核桃种仁中不仅缩合单宁含量的平均值较高(18.65 mg·g-1)，其总酚含量的平均值也达到11.73 mg·g-1，明显高于常见食用坚果腰果(AnacardiumoccidentaleLinn.)、松子〔部分松属(PinusLinn.)植物的种子〕和开心果〔阿月浑子(PistaciaveraLinn.)〕的总酚含量(分别为1.37、0.32和8.67 mg·g-1)[20]。形成这一现象的原因一方面与植物本身的遗传特性、次生代谢途径以及生长状况或生长环境的差异有关，另一方面与总酚含量测定过程中所用标准品以及总酚提取方法的差异有关。通常植物中总酚含量测定所用的标准品有绿原酸[8]、鞣花酸[6]和没食子酸[21-22]等，但由于薄壳山核桃种仁中含量最高的酚类成分是鞣花酸[17]，因而本研究选用鞣花酸作为总酚测定的标准品。De La Rosa等[17]的研究结果显示：经过酸解的薄壳山核桃提取液中鞣花酸和没食子酸的含量较高，而未经过酸解的提取液中儿茶素和表儿茶素的含量较高；Villarreal-Lozoya等[8]用NaOH和HCl溶液对薄壳山核桃总酚提取液进行碱解和酸解，则总酚提取液中鞣花酸含量最高(2.50～4.73 mg·g-1)，没食子酸含量次之(0.65～1.30 mg·g-1)，儿茶素和表儿茶素含量很低；而在本研究中，没有对总酚提取液进行碱解或酸解，则总酚提取液中儿茶素含量最高。形成这一差异的原因为薄壳山核桃种仁中含量较多的缩合单宁类聚合物在碱性或酸性条件下可被分解成没食子酸和鞣花酸，因此，未被碱解或酸解的薄壳山核桃种仁的总酚提取液中儿茶素含量较高，而碱解或酸解之后鞣花酸和没食子酸含量较高。

Wu等[9]研究结果表明：在薄壳山核桃、松子、开心果、腰果和榛子等9种常见的食用坚果中，薄壳山核桃的抗氧化能力最强(179.40 μmol·g-1)，其总酚含量也最高(20.16 mg·g-1)。Villarreal-Lozoya等[8]认为，薄壳山核桃种仁的抗氧化能力与酚类成分的含量密切相关，特别是缩合单宁含量。本研究中，除表没食子儿茶素没食子酸酯外，76株薄壳山核桃单株种仁中多数酚类成分含量与总酚提取物的抗氧化能力具有极显著相关性，而果实性状指标与总酚提取物的抗氧化能力总体上无显著相关性，可见薄壳山核桃种仁所含的酚类成分均具有较明显的抗氧化能力；其中，缩合单宁含量与总酚提取物对DPPH·和ABTS+·清除能力的相关系数均较大，分别为0.512和0.480，而5种酚类化合物与总酚提取物对DPPH·和ABTS+·清除能力的相关系数均相对较小，可见不同酚类成分的抗氧化能力有一定差异。缩合单宁可能是薄壳山核桃种仁中主要的抗氧化成分，应进一步加强对薄壳山核桃种仁中缩合单宁类成分的研究。

李永荣等[23]认为，选育薄壳山核桃优良品种的关键是重视出现在不同性状中的极端值。在供试76株薄壳山核桃单株中，除表没食子儿茶素没食子酸酯含量外，70号单株种仁的其他9个指标均排名前3，其中5个指标排名第1，其总酚提取物对DPPH·清除能力(618.04 μmol·g-1)显著高于其他单株，且其种仁中总黄酮、缩合单宁和总酚含量也最高，表明70号单株可作为高酚类含量和高抗氧化能力的双优单株。除70号单株外，30号和29号单株也有6个酚类成分含量指标排名前6，可作为以高酚类含量为筛选目标的优选单株；62号、69号和34号单株的2个抗氧化能力指标均排名前10，可作为以高抗氧化能力为筛选目标的优选单株。

综上所述，不同单株种仁中酚类成分的含量及总酚提取物的抗氧化能力均存在明显差异，这为定向选育高酚类含量和高抗氧化能力的薄壳山核桃优良品种提供了种质资源。