响应面优化西兰花茎硫苷提取及其抗氧化性研究

（长沙商贸旅游职业技术学院湘菜学院，湖南长沙410116）

西兰花（Brassica oleracea L.var.Italic Planch）又名绿花菜、花椰菜、青花菜等，属十字花科芸苔属甘蓝种的一个变种。流行病学研究表明，随着十字花科蔬菜食用量的增加，多种癌症的发生率随之降低，其中以西兰花和卷心菜最为显著。Verhoeven等[1]通过研究发现70%的癌症与十字花科蔬菜的摄入量呈负相关。食用十字花科蔬菜能降低人类前列腺癌、肺癌、食道癌、膀胱癌和结肠癌等患病风险[2-3]。多项研究表明十字花科蔬菜及其某些成分具有抗癌作用，其中包括硫代葡萄糖苷（简称硫苷glucosinolates，GS）、吲哚类、吡噻硫酮等。而西兰花种苗中硫代葡萄糖苷类含量十分丰富，其对健康促进作用通常主要归功于其次生代谢产物水解产生的异硫氰酸酯（isothiocyanate，ITCs），完整的硫代葡萄糖苷几乎没有抗癌活性，只有在水解成异硫氰酸酯后才能发挥其重要的抗癌防癌作用[4]。

西兰花是十字花科主要的作物之一，然而在生产链的不同阶段产生了大量西兰花边角废料和副产品，产生的副产物叶和茎大约占西兰花的总重量的40%～50%左右[5-7]。目前，关于直接通过酶解西兰花或从油菜籽等中提取ITCs的国内外研究比较多[8-9]，而关于从西兰花茎中提取GS的研究报道比较少[10-11]；GS在内源性芥子酶等作用下水解成ITCs产生刺激性气味，尽管ITCs具有很好的抗癌等功能，但其不愉快的气味对产品感官产生很大负面影响，直接添加在产品中ITCs成分消费者难以接受[12]；然而研究表明人体的肠道菌群能够水解GS产生ITCs，从而避免了直接添加ITCs造成产品感官的缺陷[13-14]。

本试验以西兰花茎为原料，通过超声波辅助提取GS[15]，采用氯化钯分光光度法测定硫苷的含量，通过单因素研究超声功率、提取时间、物料粒径、料液比以及磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）浓度等因素对GS的提取率的影响，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，以硫苷提取量为响应指标，采用四因素三水平响应面分析方法确定GS的最优提取工艺条件；以市售苹果汁为载体测定粗提硫苷的体外抗氧化活性，以期为西兰花综合利用提供科学依据。

1 试验材料和设备

1.1 试验材料和试剂

新鲜西兰花副产物（茎）、苹果汁：市售；盐酸、氯化钯、乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（分析纯）：南京化工厂。

1.2 试验仪器

HH恒温水浴锅：金坛市中大仪器厂；VGT-1860QTD单槽超声波清洗机：广东固特超声股份有限公司；FA2004N电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TG16台式离心机：长沙英泰仪器有限公司；TYL-2AB不锈钢电热鼓风干燥箱：天津天有利科技有限公司。

2 方法

2.1 预处理

将新鲜的西兰花茎洗净，用刀切成薄片（0.1 cm～0.3 cm）后迅速在90℃热烫5 min进行灭酶处理。将灭酶后得西兰花薄片在60℃下恒温干燥后粉碎过60目筛得到西兰花茎粉末（broccoli stems powder，BSP）备用。

2.2 西兰花茎中提取硫苷的单因素试验

选择超声提取时间、超声提取功率、超声提取温度、料液比以及PBS浓度为研究变量，考察超声提取时间、超声提取功率、超声提取温度、料液比以及PBS浓度对西兰花茎硫苷提取产率的影响。

2.3 响应面分析试验

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，选取超声功率、超声时间、提取温度和料液比4个影响最为显著的因素为自变量，采用四因素三水平的响应面试验设计，见表1。

表1 Box-Behnken试验设计Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken

2.4 西兰花茎硫苷的测定方法

2.4.1 标准曲线

采用氯化钯分光光度法测定硫苷的含量[16]，测得标准曲线：

式中：y为待测液在 540 nm 处的吸光度（A540）；x为待测液的硫苷含量，mg/mL。

硫甙含量与A540呈线性正相关，因此本试验用A540表示提取液中硫甙含量。

2.4.2 样品硫苷含量测定

取上清滤液1 mL置于试管中，加入2 mL0.15%CMC-Na溶液摇匀后，加入1 mL8 mmol/L氯化钯显色液充分摇匀，在25℃下恒温放置2小时后在540 nm下测定吸光度。

2.5 西兰花茎硫苷的抗氧化能力测定

根据Biegańskamarecik等[17]ABTS法测定自由基清除活性。将0.007 mol/L ABTS溶液与0.002 mol/L过硫酸钾溶液以1∶0.5（体积比）混合在室温下避光放置12 h～16 h。测定前，将ABTS溶液用pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释直到 ABTS 溶液达到 0.700（±0.020）的吸光度。将提取上清液（50 μL）与5 mL稀释的ABTS溶液混合，37℃下反应5分钟后在734 nm测定其吸光度A734，以PBS缓冲液用作空白。平行测定3次，根据以下公式算ABTS+·的清除率，结果用μmol/mL Trolox相对值表示。

式中：A为样品吸光值；A0为空白吸光值。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 超声功率对硫苷提取量的影响

超声功率对硫苷提取量的影响见图1。

图1 超声功率对硫苷提取的影响Fig.1 The effect of ultrasonic power on the extraction volume of GS

由图1可知，超声功率由30 W升到90 W过程中，硫苷含量不断增大，在90 W时吸光值达到最大，为0.650（GS含量为0.641 mg/mL），当超声功率继续增大时，硫苷含量开始下降，原因是超声功率的增大使得硫苷水解成ITCs等物质[18]；由于在60 W和90 W测得的吸光度值无显著差异（n=3，p＞0.05），考虑节约能源与工业化生产经济可行性等因素条件下选取最佳超声功率为60 W。

3.1.2 超声时间对硫苷提取量的影响

超声时间对硫苷提取量的影响见图2。

由图2可知，超声时间由10 min到20 min过程中，硫苷含量不断增大，在20 min时吸光值达到最大，为0.602（GS含量为0.589 2 mg/mL），当进一步延长超声时间，硫苷含量开始下降，这是由于超声作用有助于硫苷水解成ITCs[18]。因此选择最佳超声时间为20 min。

图2 超声时间对硫苷提取的影响Fig.2 The effect of ultrasonic time on the extraction volume of GS

3.1.3 提取温度对硫苷提取量的影响

提取温度对硫苷提取量的影响见图3。

图3 提取温度对硫苷提取的影响Fig.3 The effect of extraction temperaure on the extraction volume of GS

由图3可知，当提取温度由20℃升到60℃时，硫苷含量先升后降，在40℃时吸光值达到最大，为0.632（GS含量为0.622 mg/mL），当温度继续升高时，硫苷含量开始下降，这是由于硫苷受热不稳定，高温下易水解成ITCs等物质[19]；试验结果表明低温条件下有利于硫苷的稳定存在，因此，选取最佳提取温度为40℃。

3.1.4 料液比对硫苷提取量的影响

料液比对硫苷提取量的影响见图4。

由图4可知，当料液比逐渐增大时，硫苷含量先增大后趋于水平，当料液比由1∶5（g/mL）增大到1∶15（g/mL）时，吸光值逐渐升高，硫苷充分溶出；当料液比由 1∶15（g/mL）增大到 1∶25（g/mL）时，吸光值趋于水平，这是由于硫苷溶出率趋于饱和。当料液比为1∶20（g/mL）时，吸光值达到最大，为0.567（GS含量为 0.506 mg/mL），由于料液比为 1∶15（g/mL）和1∶20（g/mL）的吸光值在统计学上无显著性（p＞0.05），因此，选取最佳料液比为1∶15（g/mL）。

图4 料液比对硫苷提取的影响Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the extraction volume of GS

3.1.5 PBS浓度对硫苷提取量的影响

PBS浓度对硫苷提取量的影响见图5。

图5 PBS浓度对硫苷提取的影响Fig.5 The effect of PBS buffer concentration on the extraction volume of GS

由图5可知，当PBS浓度逐渐增大时，硫苷含量先增大后逐渐减小，当PBS浓度为0.6 mol/L时，吸光值达到最大，为0.612（GS含量为0.600 mg/mL）。由于0.4 mol/L和0.6 mol/L的吸光值在统计学上无显著性（p＞0.05），因此，考虑节约能源与工业化生产经济可行性等因素条件下选取最佳PBS浓度为0.4 mol/L。

3.2 响应面法优化硫苷提取工艺

采用Design-Expert 8.0.6对试验数据进行回归分析，拟合二次多项式方程，用R2表示拟合度；采用F检验对响应面试验数据进行方差分析以评价模型的统计学意义。

3.2.1 Box-Behnken设计方案及试验结果

根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，依据单因素试验结果，结合最小显著性差异分析，选取超声时间、超声功率、提取温度和料液比4个条件作为主要因素，以硫苷浓度（mg/mL）为响应值。依据Design-Expert 8.0.6软件设计试验方案，结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及试验数据结果Table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental result

3.2.2 模型建立及方差分析

运用Design-Expert 8.0.6对表2的试验数据进行多元回归分析，得到以硫苷含量（Y）为响应值的拟合方程：

回归方程的方差分析结果见表3。

由表3可知，超声时间（A）、超声功率（B）、提取温度（C）、超声时间和超声功率的交互项（AB）、超声时间二次项（A2）、超声功率二次项（B2）、提取温度二次项（C2）和料液比二次项（D2）达到极显著水平（p＜0.01）；超声时间和提取温度交互项（AC）与提取温度和料液比交互项（CD）达到显著水平（p＜0.05）。这说明选取的试验因素对响应值的不是简单的线性关系，还能看出各因素对硫苷含量的影响大小顺序：C＞B＞A＞D。

表3 响应面二次回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic regression equation

图6 超声功率和超声时间交互作用影响硫苷提取量的曲面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus ultrasonic power and ultrasonic treatment time

该模型的 R2值为 0.977 6（p＜0.01），虚拟项不显著（p=0.070 8），说明通过二次回归得到的硫苷含量模型与试验拟合度良好、误差小；模型的校正系数RAdj2=0.955 2，表明此回归模型可以解释95.52%响应值变化，说明此法可靠、具有可行性。

通过软件分析得出最佳提取条件为：超声时间22.42 min、超声功率79.59 W、提取温度37.96℃、料液比1∶16.56（g/mL），在此条件下硫苷提取量的预测值为0.740 mg/mL。基于工业化实际可操作性等因素考虑，将最佳提工艺条件调整为：超声时间22 min、超声功率80W、提取温度 40℃、料液比 1∶16（g/mL），在此条件下进行3次平行试验，提取的硫苷含量为0.732 mg/mL，与理论值相对误差为1.1%，说明试验结果与模型符合良好。

3.2.3 因子交互作用分析

应用Design-Expert 8.0.6软件分析因素交互作用响应面及等高线图（见图6～图11），通过该组动态图即可对任何两个因素交互影响提取西兰花茎硫苷含量的效应进行分析与评价。所拟合的响应曲面和等高线图能较直观地反映各因素间的交互作用对响应值的影响，其中等高线呈圆形说明两个因素交互作用不显著，等高线呈椭圆说明两个因素交互作用显著。

图8 料液比和超声时间交互作用影响硫苷提取量的曲面图和等高线图Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus solid-liquid ratio and ultrasonic treatment time

图9 提取温度和超声功率交互作用影响硫苷提取量的曲面图和等高线图Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus ultrasonic power and extraction temperature

图10 超声功率和料液比交互作用影响硫苷提取量的曲面图和等高线图Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus ultrasonic power and solid-liquid ratio

图11 提取温度和料液比交互作用影响硫苷提取量的曲面图和等高线图Fig.11 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus extraction temperature and solid-liquid ratio

由图6～图11可以看出，每个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，每个响应面都有极高值，出现在等高线的圆心处。其中超声时间（A）和料液比（D）的等高线图与圆形最接近，说明他们之间的交互作用对硫苷含量提取的影响最小，其次是超声功率（B）和超声温度（C）、超声功率（B）和料液比（D）。而等高线越扁平则表示两因素的交互作用越大，超声时间（A）和超声功率（B）的交互作用对硫苷提取量的影响作用最大。

3.3 西兰花茎硫苷的抗氧化结果分析

以最优工艺组合对西兰花茎进行提取，以100 mL市售苹果汁为载体，苹果汁添加西兰花茎提取物的抗氧化结果见表4。

表4 西兰花茎提取物的抗氧化结果（n=5，平均值±标准偏差）Table 4 The antioxidant activity result of extracts from broccoli stems（n=5，average value ± standard deviation）

西兰花茎提取物抗氧化结果见表4，与原苹果汁抗氧化能力4.08 μmol Trolox/mL相比，通过添加西兰花茎提取物能显著提高苹果汁的抗氧化能力（p＜0.05）；添加西兰花茎提取原液使得苹果汁的抗氧化能力提升62.99%，而添加西兰花茎提取液的冻干物使得苹果汁的抗氧化能力提升了124.51%。

4 结论

本研究对超声辅助提取西兰花茎中硫代葡萄糖苷的各个相关因素进行了研究，在单因素试验的基础上，对超声辅助法提取西兰花茎中硫代葡萄糖苷的提取条件进行了响应面优化，并通过验证试验得到了最佳超声辅助提取西兰花茎中硫代葡萄糖苷的工艺条件，即超声时间22 min、超声功率80 W、提取温度40℃、料液比1∶16（g/mL），从西兰花茎中提取的硫苷总含量为0.732 mg/mL。在现有的研究基础上，初步探讨了与硫代葡萄糖苷相关的4个不同因素对硫苷提取量的影响，对提取物的抗氧化性进行分析，结果显示在添加提取原液和冻干物两种形式的西兰花茎提取物，抗氧化值由原来的4.08 μmol Trolox/mL分别提高到6.65 μmol Trolox/mL 和 9.16 μmol Trolox/mL，平均提高了2倍～3倍，并达到了预期效果，试验结果为从天然材料中提取硫代葡萄糖苷的工业化生产提供理论依据。