miniSTR基因座及其检测系统在降解检材中的法医学应用

王 鑫 ，陈维忠 ，张 健 ，李景辉 ，孙元鹏 ，石云杰 ，张 雷 ，陈林丽 ，周 翔 ，周如华

（1．苏州市公安局物证鉴定所，江苏 苏州 215131；2．无锡中德美联生物技术有限公司，江苏 无锡 214174）

20世纪90年代，短串联重复（short tandem repeat，STR）序列遗传标记开始应用于法医物证学的研究及鉴定[1]。STR基因座的复合扩增技术以灵敏、准确、快速、信息量大等优点被广泛应用于个体识别和亲子鉴定[2-3]。然而，在法医物证学鉴定过程中，现场生物检材的提取、保存及送检容易受到环境影响，导致DNA分子结构降解、DNA含量降低以及抑制剂浓度增高，从而影响DNA检验及分型[4-7]。如何对降解和微量的生物检材进行DNA检验已成为法医物证学检验的一大难点。使用常规的荧光标记STR试剂盒对降解和微量的生物检材检验，经常会出现长片段的STR基因座丢失或者检验失败。本研究拟采用miniSTR技术，即通过在STR基因座核心重复序列的侧翼序列设计引物，尽可能缩短复合扩增产物的片段，从而提高STR分型成功率[8-10]。

1 材料与方法

1.1 样本

652份实际案件样本（血迹112份，烟蒂135份，精斑30份，肋软骨10份，脱落细胞365份），均来源于苏州市公安局物证鉴定所；种属特异性测试样本——狗、猪、牛、羊、鼠、猫、兔和大肠杆菌购于市场［猪、牛、羊购于当地菜市场，鼠、兔血样采集于温州医科大学实验动物中心，狗、猫DNA采集宠物狗和宠物猫唾液样本，大肠杆菌菌种购买于生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2 DNA提取和定量

DNA提取采用ReadyAmpTM基因组DNA提纯系统（genomic DNA purification system，美国 Promega公司）、磁珠DNA提取试剂盒（苏州新海生物科技股份有限公司）和AGCU高效硅珠DNA提取纯化试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）提取，对使用磁珠和硅珠提取的DNA采用Qubit®3.0荧光定量仪（美国Life Technologies公司）进行定量。

1.3 复合PCR扩增体系的建立

1.3.1 STR基因座选择及miniSTR引物设计

本研究最终构成的复合扩增体系包含15个来自AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR 扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）的常染色体STR基因座，1个Y染色体基因座DYS391以及Amelogenin（表1）。使用Primer Premier 5.0和Oligo 7设计引物（表2），复合扩增体系中的各引物满足以下条件：引物碱基分布随机、Tm值相近、GC含量在40%～60%、引物自身及引物之间不应存在互补序列[11]。使用BLAST®（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对设计的引物进行比对分析。

表1 17个遗传标记的相关信息

表2 17个基因座的引物信息及浓度

续表2

1.3.2 PCR扩增条件

PCR反应体系包含：PCR扩增缓冲液Master Mix（无锡中德美联生物技术有限公司）10μL，六色mini引物 5μL，基因组 DNA 0.1～2.0ng，纯水补至 25μL。扩增使用9700型PCR仪（美国AB公司），根据试剂盒说明书推荐的循环条件：95℃ 5min；94℃ 15s，59℃ 50s，65℃ 30s，循环 29次；60℃ 7min。扩增产物于4℃保存。

1.3.3 电泳及STR分型

1 μL的PCR产物与0.5 μL内标（无锡中德美联生物技术有限公司，Marker SIZ-500，SIZ荧光标记）和10μL去离子甲酰胺（美国Thermo Fisher Scientific公司）混合，95℃变性3min后冰浴，电泳检测。使用3500xL基因分析仪（美国AB公司）以1.2kV 24s进行电泳分离，使用GeneMapper®ID-X 1.4软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行结果分析。

1.3.4 等位基因分型标准物的制备

使用荧光标记引物扩增不同检材，收集17个基因座上不同等位基因的样本。使用非荧光标记引物对收集到的样本进行单基因座扩增，并使用分子克隆技术和碱裂解法制备17个基因座的不同等位基因质粒，以质粒为模板，使用每个基因座对应的荧光标记引物分别使用9700型PCR仪进行PCR扩增，并混合扩增产物，经组合调平，最终制成等位基因分型标准物。

1.4 扩增体系技术指标验证

1.4.1 分型一致、种属特异性及稳定性验证

652份案件样本按本研究方法进行扩增与分型检测，其中常染色体基因座分型结果与AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒分型结果进行比较，DYS391分型结果与YfilerTMPlus PCR扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）分型结果进行比较。

种属特异性验证分别采用狗、猪、牛、羊、鼠、猫、兔和大肠杆菌等生物检材，提取DNA后使用上述复合扩增体系进行PCR扩增检验，检测是否出现特异的DNA分型。

将试剂盒中的试剂PCR扩增缓冲液、六色mini引物、等位基因ladder和内标SIZ-500进行反复冻融和复合扩增检验，冻融次数分别为10、15、20次。

1.4.2 灵敏度、混合样本、抗抑制能力及扩增循环次数验证

灵敏度验证选用DNA标准品9948（美国Promega公司），根据浓度进行倍比稀释，取总模板量分别为500、250、125、50、30 pg 的DNA 标准品 9948 进行平行重复检测3次。

混合样本制备选用DNA标准品9947A（美国Promega公司）和9948，根据定量结果及浓度分别按19∶1、9∶1、5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5、1∶9、1∶19 的比例混合，模板总量为1ng，平行重复检测3次。

抑制剂包括血红素（美国Thermo Fisher Scientific公司）、血红蛋白（美国Sigma-Aldrich公司）、靛蓝（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、腐殖酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA，美国 Sigma-Aldrich 公司）与钙离子（美国Sigma-Aldrich公司）。在含有0.5 ng DNA标准品 9948的 25 μL体系中，加入终浓度为 75～150 μmol/L 血红素、20～50 μmol/L 血红蛋白、14～20 mmol/L 靛蓝、100～175 ng/μL 腐殖酸、800～1600μmol/L EDTA与1～2.5mmol/L钙离子作为抑制剂，进行PCR产物检测，考察试剂盒对不同浓度抑制剂的耐受能力。

根据《法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》（GA/T 815—2009）选用125pg的DNA标准品9948，按照上述复合扩增体系进行PCR扩增检验，扩增条件中循环次数分别选择26、28、29、30、32，并且平行重复检测 3 次。

1.4.3 stutter比例验证

对652份案件样本检测结果进行分析，统计六色荧光标记 miniSTR系统和AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒每个基因座的stutter峰高比例，并计算标准差（standard deviation，SD）。

1.4.4 DNA提取方法与案件检材适应性验证

对652份样本外的60份血迹、64份烟蒂、30份精斑、10份肋软骨、80份接触性棉签擦拭子采用不同方法提取DNA并定量，进行扩增检测。

分别采用Chelex-100法、磁珠法、硅珠法提取样本DNA进行上述复合扩增检验，根据分型结果比较不同提取方法对分型结果的影响。

1.4.5 降解检材检验能力验证

取实验室陈旧降解血液样本1份（AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒检测分型不完整）使用磁珠法提取DNA、DNaseⅠ（日本TaKaRa公司）处理标准品1份（1 ng标准品9948中加入0.1 U DNaseⅠ酶，15℃反应2 h），使用该六色荧光标记miniSTR系统进行检测。

2 结 果

2.1 分型一致、种属特异性及稳定性验证

652份实际案件样本的DNA提取产物，使用本次研究的六色荧光标记miniSTR系统、AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒和YfilerTMPlus PCR扩增试剂盒进行平行检验，有效DNA检验STR分型结果一致。

对狗、猪、牛、羊、鼠、猫、兔和大肠杆菌等生物检材的DNA进行检测，在分型范围内，均没有出现特异的DNA分型。

对六色荧光标记miniSTR系统中的主要组分进行稳定性测试，试剂经过反复冻融和复合扩增检验，采用标准品9948检测，结果显示，STR分型完整，图谱分布均衡。反复冻融20次仍能获得完整的STR分型。

2.2 灵敏度、混合样本、抗抑制能力及扩增循环次数验证

取总模板量 500、250、125、50、30 pg 的 DNA 标准品9948，使用本研究的复合扩增试剂进行检验，扩增条件中的循环次数分别为29和30次循环，根据分型结果统计基因座的检出率。统计结果发现，总模板量为30pg的DNA标准品9948，循环29次，漏检4个基因座，循环30次，漏检2个基因座。而总模板量为50pg及以上的DNA标准品9948均能获得完整STR分型。因此，本研究的六色miniSTR的检测灵敏度为50pg DNA。

混合样本DNA检验结果显示，分型分布与两者在混合物中的浓度比例相关（图1）。混合物浓度比例相近（在5∶1和1∶5之间），两者的STR分型分布均衡，90%以上的次要基因座能够得到有效分型。随着混合物比例差异的增加，次要成分的STR分型分布出现下降，当混合物浓度比例达到19∶1和1∶19时，浓度低的样本STR基因座分布仅约53%。

图1 标准品9947A与9948不同混合比例下的次要成分基因座平均检出率

当血红素浓度不大于125μmol/L，各基因座均可获得有效扩增；血红蛋白在40 μmol/L以内，对试剂盒扩增没有影响；靛蓝浓度在16 mmol/L以内，对试剂盒扩增没有影响；腐殖酸浓度不高于150 ng/μL时，各基因座均可获得有效扩增；EDTA浓度不高于1200μmol/L时，各基因座均可有效扩增；钙离子浓度不高于2mmol/L时，各基因座均可有效扩增。

125pg的DNA标准品9948的STR分型的荧光信号与扩增循环次数成正相关。当循环28次以上时，标准品9948的STR分型完整，分布均匀，产物扩增峰值随着扩增循环次数增加，位于500～30 000 RFU，但是循环32次的扩增信号过强，出现荧光渗透峰。当循环26次，标准品9948的STR分型结果出现部分基因座的丢失，因此，根据反复的复合扩增测试，推荐使用循环29次进行案件样本的检测。若样本浓度高于500pg可以相应减少循环数，反之亦然，但不要超过31个循环，避免加重PCR的随机扩增效应。

2.3 stutter峰高比例验证

采用六色荧光标记miniSTR系统及AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒平行扩增652份案件样本，并对stutter峰高比例进行统计分析，两个试剂盒中每个基因座的stutter峰高比例平均百分比均在12%以下，且stutter峰高比例高或低的基因座，在两个试剂盒间不存在明显差异性（表3）。

表3 各基因座stutter峰高比例平均百分比 （n=652）

2.4 实际案件样本检测与检材适应性验证

本研究中的常规检材（血迹、烟蒂、精斑、肋软骨）检出率，采用六色荧光标记miniSTR系统和AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒均为93.73%（269/287），脱落细胞的检出率采用六色荧光标记 miniSTR系统和 AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒分别为26.03%（95/365）和25.75%（94/365）。选取另外60份血迹样本、64份烟蒂样本、30份精斑、10份肋软骨、80份接触性棉签擦拭子分别使用3种DNA提取方法（Chelex-100法、磁珠法、硅珠法）进行DNA提取及六色荧光标记miniSTR系统复合扩增检验，STR分型结果完整，峰值分布均衡。

2.5 降解检材检验能力验证

实验室陈旧降解血液样本和DNaseⅠ处理的标准品经六色荧光标记miniSTR系统检测，均获得完整分型。

3 讨 论

商业化STR试剂盒在扩增降解、含高抑制剂的样本时，大片段扩增效率会明显下降甚至丢失，缩短扩增片段长度可以提高降解检材和含高抑制剂检材的检出率。本研究的检测系统在靠近STR基因座核心重复区设计引物减小扩增子片段长度，将15个常染色体STR基因座、1个Amelogenin基因座和1个DYS391基因座合理排布于300bp（包含了FGA国外人群稀有等位基因42.2～50.2，最长的50.2可达307.8bp以内。引物设计时，避免由于引物3′端序列同源性较高而导致错误。同时考虑引物在不同检材扩增的适用性，保证不同检材扩增时，扩增效率都要满足试剂盒均衡性要求。通过对陈旧降解样本和DNaseⅠ处理标准品检测，六色荧光标记的16个miniSTR可以有效获得完整分型，适用于降解样本检测。与AmpFℓSTR®miniFilerTMPCR扩增试剂盒（美国AB公司）不同，本检测系统的miniSTR基因座包含AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒全部的基因座，与数据库兼容性高，且扩增子小于300bp。另外，在检测系统中新增DYS391基因座，可以在Y等位基因缺失的情况下辅助提供性别信息。针对PCR扩增的抑制剂，筛选高性能的PCR缓冲系统，优化热循环参数，显著提高了体系扩增性能。本研究采用新型的能量转移染料、优化的PCR缓冲体系、以miniSTR理念设计的更小的扩增子，改善了在降解、微量样本中容易出现大片段丢失的情况。同时，合理的位点排布也避免了类似的miniSTR检测系统（如AmpFℓSTR®miniFilerTMPCR扩增试剂盒）仅作为补充试剂盒的作用，本系统可以应用于案件现场样本检测和建库样本检测。经过性能评价实验，六色荧光标记的16个miniSTR试剂盒具有较高的检测灵敏度、抗抑制剂能力强、特异性好、扩增系统试剂组分稳定，适用于混合样本等特殊检材的DNA检验分型。对实际案件样本的检出率达到甚至超过 AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒的水平，可用于实际案件检验，为法庭科学DNA分析提供一种新方法。