北极海参不同酶解多肽的抗氧化活性与高效液相色谱分析

曹学彬， 王建波， 邢荣莲， 姜爱莉

(1.山东东方海洋科技股份有限公司/国家海藻与海参工程技术研究中心，山东烟台 264000； 2.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005)

小分子量的多肽容易被人体吸收，具有对人体有益的各种生理功能[1-2]。抗氧化性多肽是生物活性肽的一种，通过减少氧自由基、羟自由基(·OH)从而达到抗衰老的功能[3-5]，使用安全性高。海参(Acaudinamolpadioidea)是典型的高蛋白、低脂肪、极低胆固醇、富含矿物质和维生素的优质食品，体壁富含蛋白质、皂苷、多糖等营养成分，具有多种保健功能及药用价值，是制备生物活性多肽的理想原料[6-7]。

海参多肽具有良好的溶解性和稳定性特点，易消化吸收，而且具有降血压、预防心脑血管疾病、抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等生物活性[8-9]。来自海参的生物活性肽有两大类，一类是存在于生物体中的天然多肽，如海参上皮组织中具有抗肿瘤和抗炎活性的五肽，由亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、精氨酸等氨基酸构成，其中个别氨基酸为D-型[10]；另一类是海参生物蛋白质酶解产生的活性肽，如Zhao等连续酶解海参制备得到的ACE抑制多肽[11]。

不同种类的海参由于生活环境和摄食不同，其营养价值和生理功效也有所差异[12]。苏永昌等研究了地瓜参多肽抗氧化活性[13]；赵芹等系统分析了不同分子量的刺参(Apostichopusjaponicus)、菲律宾刺参(Pearsonothuriagraeffei)、美国肉参(Isostichopusbadionotus)和冰岛刺参(Cucumariafrondosa)等海参多肽抗氧化活性[14]；陈卉卉等对东海海参胶原多肽的制备及自由基清除功能进行了研究[15]。

酶解水产品蛋白质进行深加工是经常采用的一种加工方法，也是获取抗氧化多肽的重要途径[3-4]。曾庆祝等研究表明，枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解扇贝边所得酶解物具有较好的·OH清除效果，其清除率分别为84.37%、79.93%，这2种酶解物均可提高小鼠血液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，并降低小鼠肝脏中丙二醛(MAD)含量[16]。

北极海参(Holothuriamexicana)产于北大西洋深海，无污染、纯野生，营养丰富，蛋白质占干物质含量的60%以上。由于原产地居民不食用海参，北极海参价格显著低于黄渤海刺参，目前对于北极海参的活性成分及活性研究报道较少，对其多肽的生理活性进行深入研究，对该资源的开发利用具有较大的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

北极海参购自山东烟台海参市场，常规方法水发，低温保存备用。胃蛋白酶、胰蛋白酶购自北京拜尔迪生物技术有限公司；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶购自北京东华强盛生物技术有限公司；牛血清白蛋白标品购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海参多肽的制备

1.2.1.1 海参体壁蛋白的提取 发制好的海参组织用捣碎机搅碎，加入10倍体积的0.1 mol/L NaOH溶液，40 ℃水浴搅拌12 h，离心收集上清，加入10%三氯醋酸(TCA)于4 ℃沉淀3 h，离心收集沉淀，丙酮反复洗涤至沉淀为白色，冷冻干燥得海参体壁蛋白。

1.2.1.2 酶解工艺流程 海参体壁蛋白溶解，分别加入5种蛋白酶溶液，酶的用量为2 500 U/g。分别在各种酶的最适条件下水解3 h，100 ℃加热0.5 h灭酶，4 000 r/min离心，上清液中加入3倍体积无水乙醇，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，即为海参多肽溶液。福林酚法检测多肽含量。

1.2.2 体外抗氧化能力的测定

1.2.2.1 羟自由基(·OH)的体外清除作用 采用Fenton法[17-18]测定海参多肽对羟自由基(·OH)的体外清除作用，·OH采用EDTA Na2-Fe2+-H2O2体系产生。

清除率=(D样品-D空白)/(D对照-D空白)×100%。

式中：D样品、D空白、D对照分别为测试样品、空白和对照的吸光度。

1.2.2.3 还原力的测定 参照Yen等的方法[20]。

1.2.3 海参多肽的分子量分布 采用安捷伦1 200高效液相色谱仪分析5种酶解多肽的分子量分布。色谱条件：TSK PW4000凝胶柱，柱温25 ℃，自动进样5 μL，流动相为纯净水，流速1 mL/min，214 nm检测。

2 结果与分析

2.1 海参多肽的制备

试验表明，酸性蛋白酶水解海参蛋白所得的酶解多肽(AP)得率最高，为89.7%；其次是胰蛋白酶酶解多肽(TP)，得率为88.6%，木瓜蛋白酶酶解多肽(PAP)得率为76.3%，中性蛋白酶酶解多肽(NP)得率为70.5%；胃蛋白酶水解蛋白所得的多肽(PP)得率最低，仅为70.5%。

2.2 5种酶解多肽对羟自由基的清除能力

由图1可知，几种酶解多肽对羟自由基的清除率均随多肽浓度的增加而提高，当TP、PAP、AP的浓度为1.6 mg/mL时，对羟自由基的清除率已经达到100%。相同浓度下，木瓜蛋白酶酶解多肽PAP对羟自由基的清除能力最强，其半清除浓度IC50为0.277 mg/mL，中性蛋白酶酶解多肽NP的IC50为0.414 mg/mL，胰蛋白酶酶解多肽TP及酸性蛋白酶酶解多肽AP的IC50为0.342 mg/mL，胃蛋白酶酶解多肽对羟自由基的清除率最低。清除能力强弱顺序为PAP>TP≈AP>NP>PP。

2.3 5种酶解多肽对超氧阴离子的清除能力

由图2可知，几种酶解多肽对超氧阴离子的清除能力均随多肽浓度的增加而提高，相同浓度下，胰蛋白酶酶解多肽TP对超氧阴离子的清除能力最强，IC50为 0.966 mg/mL，其次是酸性蛋白酶酶解多肽AP，IC50为 1.177 mg/mL，中性蛋白酶酶解多肽NP的IC50为 2.150 mg/mL，木瓜蛋白酶酶解肽PAP的IC50为 2.325 mg/mL，胃蛋白酶酶解多肽PP对超氧阴离子的清除率最低，尤其是在较高浓度下。清除能力强弱顺序为TP>AP>NP>PAP>PP。

2.4 5种酶解多肽的还原能力

还原能力也是抗氧化能力的一个指标，但是还原能力在抗氧化过程中所起作用大小目前还不清楚。从图3可以看出，5种酶解多肽的还原能力均与浓度呈正相关，其中酸性蛋白酶酶解多肽AP的还原能力最强，其次是中性蛋白酶酶解多肽NP和胰蛋白酶酶解多肽TP，胃蛋白酶酶解肽PP和木瓜蛋白酶酶解肽PAP的还原能力相对较弱，远低于其他3种酶解多肽。

2.5 酶解海参多肽的高效液相分析

利用高效液相色谱分析5种海参酶解多肽的分子量分布，结果(图4)显示，胃蛋白酶酶解多肽PP的分子量分布范围窄，肽段主要集中在8～20 ku，其中分子量为14 ku左右的占了大部分；中性蛋白酶酶解多肽NP的分子量分布范围宽，低分子量肽段(小于7 ku)含量比较高；胰蛋白酶酶解多肽TP的分子量小于7 ku的占了大部分；酸性蛋白酶酶解多肽AP的分子量范围分为两部分，一部分在20～7 ku，另一部分在 7～3 ku；而木瓜蛋白酶酶解多肽PAP的大部分肽段分子量在20～14 ku，还有少量肽段分子量5～7 ku。

3 讨论

对海洋生物的研究发现，多肽的生理作用与组成多肽的氨基酸序列有关[21-22]；一些生物活性肽的生理功能还与多肽的结构、疏水性、所带电荷等有关[23-24]。许多研究表明，海参多肽的抗氧化性与分子量密切相关，不同分子量范围的海参多肽清除氧自由基的能力存在差异[25]，但抗氧化活性与分子量并不是呈正相关关系，多肽的抗氧化性还取决于组成多肽的氨基酸组成和序列[26]。由于短肽含有某些能与自由基反应的特殊基团即供氢基团，只有当这些短肽分子量适当时，这些特殊的供氢基团才能得到最大的暴露，进而充分地与自由基作用，此时才具有较强的抗氧化性[26]。Qian等指出，含巯基的半胱氨酸能够直接与自由基作用，对多肽的抗氧化性有重要贡献[27]。Saiga等发现，含酸性氨基酸的短肽具有较好的抗氧化效果，原因是酸性氨基酸的侧链羧基能钝化金属离子，终止自由基链式反应[28-30]。

本研究中所用的5种蛋白酶对于酶切位点的选择性是有差异的。中性蛋白酶酶切位点多，对底物肽键的选择性大，酶解得到的NP的分子量大部分集中在小分子量部分；酸性蛋白酶是将2个疏水氨基酸打断，作为内肽酶的同时还可以切开蛋白或多肽羧基或氨基末端肽键，游离出氨基酸，同时也可以水解蛋白多肽酯键，水解范围相对较宽，但是对芳香族氨基酸没有特异性；胃蛋白酶水解肽键两端必须是疏水性氨基酸、芳香族氨基酸氨基与其他氨基酸形成的肽键，如果是脯氨酸则不水解，制备的多肽含有的芳香族氨基酸含量较少或者2个芳香族氨基酸在蛋白中的距离较远；胰蛋白酶酶切赖氨酸、精氨酸羧基与别的氨基酸形成的肽键，制备的蛋白内含有赖氨酸及精氨酸的残基相对要多；木瓜蛋白酶不但有蛋白酶、酯酶活性，还具有合成功能，可把蛋白水解物合成为类蛋白质，可水解蛋白质和多肽中赖氨酸和精氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N端具有2个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键，也可以通过切断壳聚糖的β-1，4糖苷键降解植物细胞壁中壳聚糖。5种蛋白酶酶切位点的不同，酶解得到的多肽分子量及氨基酸残基也有所不同，相应地，表现出的体外抗氧化活性也就有较大的差异。

4 结论