香菇多糖对新辅助化疗后乳腺癌患者免疫功能及淋巴细胞的影响

鲁海燕，张喜平

(内蒙古医科大学附属医院普外科，内蒙古 呼和浩特 010050)

随着人口老龄化、饮食结构、生活环境的变化以及其他因素的影响，乳腺癌近年来发病率呈明显上升趋势，已俨然成为女性患者尤其是老年女性群体最为常见的恶性肿瘤，且有发病年龄年轻化的趋势[1-2]。肿瘤微环境是指包含内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞和细胞间基质等在内的相互协同作用，从而利于肿瘤细胞生长、转移的特殊环境。研究证实，肿瘤微环境在肿瘤的病理生理过程中发挥着决定性的作用[3-5]。肿瘤微环境中的淋巴细胞反映出患者的免疫功能状态以及对抗肿瘤的能力，研究证实Foxp3+Tregs是乳腺癌患者中无病生存时间和总生存率的独立预测指标，且与肿瘤分型有关，并能在肿瘤组织内差异性分布，证实肿瘤微环境中免疫细胞与患者预后息息相关，因此可以作为肿瘤治疗的重要手段[6-8]。香菇多糖具有免疫调节作用，对固有免疫和获得性免疫均有调节作用，可以提高机体免疫力[9]。但目前其免疫调节机制尚不明确，在乳腺癌患者中研究也较少，因此本研究通过前瞻性纳入接受新辅助化疗的乳腺癌患者，探讨香菇多糖对此类患者免疫功能以及肿瘤微环境中浸润淋巴细胞的影响，以求为临床提供相应的理论支持。

1 资料与方法

1.1一般资料前瞻性纳入自2015年1月至2016年10月内蒙古医科大学附属医院收治的乳腺癌患者。入组标准：①明确诊断为乳腺癌；②入组前4周未接受化疗或放疗；③年龄范围为18～70岁；④预期寿命≥3月，ECOG评分≤2分；⑤知情并同意此研究。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并严重的心、肺、肾、肝脏功能障碍；③合并自身免疫性疾病或长期应用激素；④使用其它免疫调节剂；⑤研究期间放弃治疗、失访、转院等。根据以上标准，研究期间共入组乳腺癌患者88例，采用随机、对照、单盲的方法将患者分为观察组和治疗组，每组各44例患者。观察组年龄(57.53±8.57)岁，年龄范围为40～68岁；病理分型其中浸润性导管癌30例，乳头状癌6例，单纯癌5例，髓样癌3例；雌激素受体阳性29例，孕激素受体阳性25例，人表皮生长因子-2受体阳性20例；组织分化程度其中高分化的8例，中分化的20例，低分化的11例，不能判别分化程度5例。对照组年龄(58.69±9.35)岁，年龄范围为43～70岁；病理分型其中浸润性导管癌28例，乳头状癌8例，单纯癌6例，髓样癌2例；雌激素受体阳性27例，孕激素受体阳性23例，人表皮生长因子-2受体阳性21例；组织分化程度其中高分化的7例，中分化的19例，低分化的14例，不能判别分化程度4例。两组患者治疗前一般临床资料比较均差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。本研究通过内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准，所有患者或其家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2治疗方法所有患者入院均常规完善乳腺、淋巴结超声，胸腹部CT等检查，必要时行核磁共振，骨组织核素扫描等检查。两组患者均给予相同新辅助化疗方案，每次化疗前均常规检查血常规、肝肾功能、心电图等检查以排除化疗禁忌。新辅助化疗方案为CAF方案化疗：疗程第1天和第8天静脉注射环磷酰胺500 mg·m-2， 5-氟尿嘧啶500 mg·m-2，多柔比星50 mg·m-2为疗程第1天使用。每21 d为1疗程，术前共给予3～4个疗程，每2～3疗程结束时行影像学检查评估疗效。新辅助化疗结束后行改良根治术，围手术期给予营养、血糖、血压、内环境、心肺功能支持等对症治疗。观察组在此基础上给予香菇多糖(天地欣，南京绿叶制药有限公司，生产批号Z20080579)治疗。用法用量：香菇多糖1 mg+5%葡萄糖注射液250 mL静脉滴注，1周2次，患者非住院期间在社区卫生院输注。所有患者外周血免疫细胞检测期间均未行分子靶向治疗。

1.3观察指标及检测方法一般临床资料包括年龄、性别、病理分型、组织分化程度等。肿瘤组织切片后常规HE染色和免疫组化(IHC)染色，雌激素或孕激素≥1%定义为激素受体阳性；人表皮生长因子-2受体检测首先采用IHC初筛，IHC 0/1+诊断受体阴性，IHC3+诊断为受体阳性；IHC2+患者进一步行荧光原位杂交法(FISH)检测明确受体基因扩增状态以明确诊断。主要观察指标包括：肿瘤组织中淋巴细胞浸润程度如CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比例等；外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞水平；血清白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)浓度。肿瘤组织淋巴细胞浸润情况：手术中留取肿瘤组织标本，洗净、剪碎、PBS制成细胞悬液，去碎片和细胞团后取得细胞沉淀，分离淋巴细胞后加入单克隆抗体反应30 min，使用Epics XL型流式细胞仪(Beckman，美国)检测CD4+和CD8+T细胞。外周血CD4+和CD8+T细胞：治疗前及手术前留取外周血标本，使用Epics XL型流式细胞仪(Beckman，美国)检测患者外周血中CD4+和CD8+T细胞。血清白细胞介素-2(IL-2)、IL-6、IL-10、TGF-β1浓度：治疗前及手术前留取外周血标本，离心后将血清冻存于-80 ℃冰箱，后集中采用Elisa法(云克隆，武汉)检测。

表1 两组一般资料比较

1.4统计学方法所有数据均采用SPSS 22.0统计软件完成分析，两组患者计量资料采用两独立样本t检验，组间计量资料采用配对样本t检验。分类资料采用χ2检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组肿瘤组织淋巴细胞浸润水平比较观察组肿瘤组织微环境CD4+T细胞(21.56%±5.08% 比 23.95%±5.17%,t=2.187,P=0.031 )低于对照组；CD8+T细胞(29.52%±3.51% 比 27.47%±3.68%,t=2.673,P=0.009)高于对照组；CD4+/CD8+T细胞比例(0.72±0.12比 0.86±0.14,t=5.036,P=0.000)亦低于对照组，均差异有统计学意义，见图1。

图1 两组患者肿瘤组织淋巴细胞浸润水平比较

2.2两组外周血淋巴细胞水平比较相比于对照组，观察组治疗后外周血CD4+T细胞水平明显增加；CD4+/CD8+T细胞比例明显增加。治疗后观察组和对照组外周血CD4+T细胞水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3两组血清IL-6、IL-10、TGF-β1浓度比较治疗前两组血清IL-6、IL-10、TCG-β1浓度差异无统计学意义(均P>0.05)。相比于对照组，观察组治疗后血清IL-6浓度明显增高(P=0.002)；IL-10浓度明显降低(P=0.004)；TGF-β1浓度明显降低(P=0.024)。治疗后观察组和对照组外周血IL-6浓度均显著降低，IL-10和TGF-β1浓度均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3 讨论

近年来越来越多的研究证实，免疫在肿瘤患者的病理生理过程中起到了极为重要的作用，活化肿瘤患者机体免疫功能有可能成为抗肿瘤的有效治疗手段[7,10-11]。现有研究结果已经证实，乳腺癌患者机体存在一定的免疫抑制，且研究表明其抑制程度越严重，整体临床预后越差[12]。乳腺癌肿瘤细胞免疫耐受与肿瘤快速生长和转移息息相关，也是患者临床预后恶化的重要因素[13]。细胞免疫在抗肿瘤作用中是最主要的执行者，T淋巴细胞，自然杀伤细胞和巨噬细胞在肿瘤微环境中发挥着主要的抗肿瘤免疫应答功能，而体液免疫通常起到协助作用[14]。在抗肿瘤细胞免疫中，活化的细胞毒性T细胞被认为是最重要的效应细胞，可通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用，因此也被认为是人体对抗肿瘤的防御最前线。细胞毒性T淋巴细胞主要包括CD4+和CD8+T淋巴细胞，CD8+T细胞为主要效应执行细胞但其激活又依赖于CD4+T细胞所分泌的Th细胞因子[15]。白海亚和马秀芬[16]研究发现CAF新辅助化疗方案可以有效提高外周血CD3+、CD4+T细胞以及自然杀伤细胞数量，降低CD8+T细胞数量，增加CD4+/CD8+比例，与本研究结果基本一致，提示有效的新辅助化疗方案在抑制肿瘤增殖同时可以改善患者免疫功能。

表2 两组患者外周血淋巴细胞水平比较

注:与治疗前对比，aP<0.05

表3 两组患者外周血IL-6、IL-10、TGF-β1水平比较

注:与治疗前对比，aP<0.05

此外，生物调节剂也是活化机体免疫功能从而发挥抗肿瘤作用的重要治疗手段之一。香菇多糖是指从优质香菇子实体中提取出来的一种多聚葡糖，具有很强免疫调节能力和抗肿瘤活性，还具有抗氧化、降血脂、抗病毒等多种药理功能，近年来在临床中得到广泛应用[17]。向冬晴和洛若愚发现香菇多糖可以有效改善Ⅳ期宫颈癌化疗患者T淋巴细胞免疫功能，提高化疗效果并减轻化疗不良反应[18]。龙爱娥[19]也发现，香菇多糖可以增强老年卵巢癌患者中化疗效果，并可以抑制实体瘤的生长和有助于控制恶性腹水。本研究结果发现香菇多糖可以有效降低肿瘤组织微环境中CD4+T细胞，同时上调CD8+T细胞比例，CD4+T细胞在肿瘤微环境中主要分化为调节性T细胞，而抑制免疫系统对机体的杀伤作用，CD8+T细胞主要分化为细胞毒性T细胞，而杀伤肿瘤细胞，香菇多糖通过降低CD4+T细胞、提高CD+T细胞，进而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。

外周血中CD4+T细胞可根据其分泌细胞因子的不同分为Th1和Th2细胞，研究证实IL-6因子可刺激其向Th1细胞方向分化，而IL-10因子则刺激其向Th2方向分化[20-23]。当Th1细胞下调而Th2上调，即所谓的Th1/Th2漂移往往会导致机体整体免疫功能下降，而Th1细胞具有抗肿瘤作用，因此也会降低机体抗肿瘤作用[24]。本研究结果发现香菇多糖可以有效降低血清IL-10和TGF-β1浓度，提高IL-6浓度，同时可以提高外周血CD4+T细胞水平和CD4+/CD8+细胞比例。TGF-β1可以调节细胞表型，抑制免疫细胞增殖、淋巴细胞分化和细胞因子差生，在细胞的生长、分化和免疫功能中具有重要的调节作用[25]，表明香菇多糖可以有效促进乳腺癌患者细胞免疫向Th1漂移，增强机体对肿瘤细胞的杀伤作用。

综上所述，香菇多糖可以有效改善乳腺癌患者机体免疫功能，调节肿瘤组织中浸润淋巴细胞免疫状态，但目前关于香菇多糖的抗肿瘤机制尚不明确，且目前研究多为单中心，小样本观察性研究，其在肿瘤中所发挥的确切作用仍需进一步深入研究。