乳鼠雪旺细胞与自体颅骨组织块体外联合培养对颅骨组织生长的影响

李钟鹏 庞芳河 (广西医科大学附属口腔医院综合门诊，广西 南宁 530021)

骨组织工程学发展迅速，在诸多领域取得良好成果，随着支架材料研究的深入，大量复合支架材料在骨缺损修复中被广泛研究〔1〕，但因神经化、血管化因素的影响使复合支架材料在临床上没有被广泛应用。组织工程化骨组织在体内存活的关键因素为完善的神经支配和充足的血液供应，近年来组织工程化骨的血液供应方面的研究取得比较大的进步〔2，3〕，但神经支配仍然是组织工程化骨面临的难题。雪旺细胞为周围神经胶质细胞，为常用的周围神经组织工程种子细胞〔4，5〕。本文将雪旺细胞与自体颅骨组织联合培养观察其对颅骨生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 实验乳鼠:出生1～5 d、清洁级、雄性、Sprague Dawley乳鼠(购自广西医科大学动物中心，许可证号为SCXK桂2014-0001)。实验试剂:BFGF和钛板(武汉德骼拜尔外科植入物有限公司)，S-100抗体、SABC试剂盒等(武汉博士德生物工程公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，Ⅱ型胶原酶、DMEM培养基、胎牛血清等(美国Gibco公司)。

1.2 雪旺细胞培养和纯化及鉴定 取乳鼠9只颈椎脱臼处死，浸泡乙醇中消毒，将消毒后乳鼠治愈解剖板上分离坐骨神经，将其剪成约1 mm3组织碎块，加入胰蛋白酶和胶原酶，移入离心管中，在水浴振荡箱中消化 35 min，加入 DMEM培养基终止消化，离心(1 000 r/min)5 min，弃去上清液，重悬离心后细胞。取细胞悬液加入RP管中，加入台盼蓝混匀，取混合液滴加到细胞计数板上，计数未被染液着色的细胞数目，将细胞(密度为1×105个/ml)接种到培养皿，12 h换液并加入阿糖胞苷，48 h换液，观察细胞生长情况。将上述细胞培养12 d，胰蛋白酶进行消化，然后接种到6孔板中培养3 d，采用S-100抗体鉴定:磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞爬片，多聚甲醛固定，PBS清洗，加入过氧化氢(H2O2)阻断血源性过氧化物酶，PBS清洗，加入胎牛血清(BSA)封闭血清，PBS清洗，加入兔S-100单克隆抗体孵育，PBS清洗，加入生物素化羊抗小鼠孵育，PBS清洗，加入SABC孵育，PBS清洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下观察出现阳性染色、背景不着色为准，晾干玻片，中性树胶封片。

1.3 颅骨组织块取材、分组及处理 取9只乳鼠断颈处死，乙醇中消毒，PBS冲洗，无菌条件下取出颅骨，剔除骨外膜、内膜等纤维结缔组织，PBS冲洗露骨组织，剪成2 mm×2 mm大小颅骨块，每只乳鼠取3块，共27块颅骨块。将27块颅骨组织块分为A组、B组和C组，每组9块，分别培养1 w、2 w、3 w。A组颅骨组织块单独培养，不加雪旺细胞干预;B组为雪旺细胞和颅骨组织快直接接触培养，将浓度为1×106个/ml的雪旺细胞悬液加入DMEM培养皿中，将颅骨组织块加入培养皿中和雪旺细胞直接接触培养;C组为雪旺细胞和颅骨组织块通过钛板间接接触培养，将浓度为1×106个/ml的雪旺细胞悬液加入DMEM培养皿中贴壁生长，放入钛板，将颅骨组织快放入钛板上的空隙内，使雪旺细胞和颅骨组织块间接接触培养。

1.4 颅骨组织BGP和OPN水平测定 三组分别在培养1 w、2 w、3 w时取材，每周取3块颅骨组织块，甲醛固定、石蜡包埋，采用常规HE染色，采用免疫组化法测定颅骨组织BGP和OPN水平，采用Image-ProP-lus6.0图像处理系统对图片进行分析，测定骨组织中阳性细胞及基质中染色光密度值。每周3个颅骨组织块，每块取4个切片，每组切片取3个视野，共36个视野，阳性表达的灰度值为该颅骨块的平均光密度值。

1.5 培养液中BALP活性含量测定 收集培养1 w、2 w、3 w时三组培养液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养液中BALP活性含量，具体步骤按照说明书进行。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行方差分析及S-N-K检验。

2 结果

2.1 雪旺细胞培养和纯化及鉴定 接种24 h后大部分雪旺细胞已贴壁生长;接种48 h后细胞呈梭形，细胞两端突起不等;接种7 d大部分雪旺细胞胞体平行排列，细胞呈极性生长;接种12 d雪旺细胞交织成网状，大部分连接在一起呈“地毯”状。见图1。对接种14 d雪旺细胞进行免疫组化染色，发现雪旺细胞边界清楚，胞体呈梭形，胞质黄染;雪旺细胞纯度在89%左右。见图2。

2.2 三组颅骨组织中BGP水平比较 三组之间BGP水平差异有统计学意义(F=18.912，P＜0.001)。两两比较:B组各时间点BGP水平明显高于A组和C组(P＜0.05)，C组各时间点BGP水平明显高于A组(P＜0.05);同组不同时间点BGP水平比较差异有统计学意义(P＜0.05)，随着时间延长BGP水平升高。见表1和图3。

图1 雪旺细胞培养结果(HE，×400)

图2 雪旺细胞免疫组化染色(DAB，×400)

表1 三组颅骨组织培养不同时间BGP水平比较(，n=36，%)

表1 三组颅骨组织培养不同时间BGP水平比较(，n=36，%)

与B组比较:1)P＜0.05;与A组比较:2)P＜0.05;与同组前一时点比较:3)P＜0.05，下表同

组别 第1周 第2周 第3周A 组 7.487±2.4961) 8.358±1.8121)3) 11.953±1.1321)3)B 组 11.895±3.602 13.703±3.4853) 18.381±5.214 C 组 9.485±3.5481)2) 10.760±2.1531)2)3) 15.925±3.2141)2)3)

图3 各组培养不同时间BGP免疫组化染色(DAB，×400)

2.3 三组颅骨组织中OPN水平比较 三组之间BGP水平差异无统计学意义(F=1.510，P＞0.05)。不同时间点和不同组间两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2和图4。

2.4 三组颅骨组织BALP活性比较 三组之间BALP活性含量差异有统计学意义(F=8.726，P＜0.05)。两两比较:B组各时间点BALP活性含量明显高于A组和C组(P＜0.05)，C组各时间点BALP活性含量明显高于A组(P＜0.05);同组不同时间点BALP活性含量比较差异有统计学意义(P＜0.05)，随着时间延长BALP活性含量升高。见表3。

表2 三组培养不同时间颅骨组织中OPN水平比较(，n=36，%)

表2 三组培养不同时间颅骨组织中OPN水平比较(，n=36，%)

组别 第1周 第2周 第3周A 组 9.669±1.304 10.124±2.138 9.203±1.063 B 组 10.786±2.115 10.197±1.212 11.034±2.142 C 组 9.272±1.008 10.710±1.058 9.135±2.285

图4 各组培养不同时间OPN免疫组化染色(DAB，×400)

表3 三组培养不同时间颅骨组织中BALP活性比较(，n=9，金氏单位/L)

表3 三组培养不同时间颅骨组织中BALP活性比较(，n=9，金氏单位/L)

组别 第1周 第2周 第3周A 组 97.434±12.2041) 102.588±24.5211)3)137.581±18.1591)3)B 组 123.203±19.634 302.789±60.4153) 709.713±48.9853)C 组 100.011±22.0451)2)214.658±21.2081)2)3)370.074±37.7561)2)3)

3 讨论

随着组织工程骨研究的深入，如何使构建的组织工程骨在体内存活并迅速发挥作用是目前面临的主要问题，骨组织为一种复合体，不是单一的硬性组织，还含有血管、神经、筋膜等其他软组织，带有血管系统和神经支配的复合组织工程骨的构建是比较理想的解决方案，在构建组织工程骨的同时重建神经支配和血液供应是组织工程骨从基础研究到临床的关键问题〔6～8〕。目前血管化组织工程骨的研究取得了较大进展〔9～11〕，而神经化组织工程骨仍是目前面临的问题。神经和营养血管进入骨髓，对骨组织的形成、发育及代谢发挥重要作用;周围神经及其分泌的神经肽对骨的再生具有重要作用，雪旺细胞的存在形式有两种，一种包绕轴突形成髓鞘，一种包绕轴突不形成髓鞘，雪旺细胞的成熟过程包括:雪旺细胞前体-不成熟雪旺细胞-成熟雪旺细胞，主要来源于神经嵴细胞，可分泌神经营养因子、神经生长因子及血小板生长因子、转移生长因子等其他细胞因子，神经营养因子具有神经再生提高支架和再生环境、清除细胞碎片、组织神经元细胞凋亡等作用;神经生长因子参与神经细胞的生长、再生和发育等;血小板生长因子等其他细胞因子可促进神经元细胞增殖分化、细胞外基质合成等〔12〕。雪旺细胞在神经细胞再生中具有重要作用，是周围神经组织工程常用的种子细胞〔13〕。BGP是重要的骨代谢指标，BGP水平高低和影响骨改建过程，成骨细胞功能增强则BGP水平升高，成骨细胞功能减弱则 BGP水平下降〔14，15〕。本研究表明雪旺细胞可促进成骨细胞功能，其中两者直接接触发挥主要促进作用。OPN有骨细胞、破骨细胞、成骨细胞分泌，为分泌性磷酸化蛋白，可识别骨基质和破骨细胞之间黏附，并通过对骨基质和破骨细胞之间黏附的调节影响骨吸收〔16，17〕，本研究发现雪旺细胞和颅骨组织共同培养对骨组织OPN水平的影响不明显，考虑雪旺细胞对颅骨组织的改建和吸收影响不大。BALP由成骨细胞生产，在骨形成和骨细胞活性中发挥重要作用，骨形成超过骨吸收时，成骨细胞分泌大量的BALP，引起BALP活性增加〔18〕，本研究发现雪旺细胞可增加骨组织BALP活性，促进骨组织生长，其中两者直接接触发挥主要促进作用。