兰茵凤扬化浊解毒方治疗大鼠溃疡性结肠炎的作用机制

张 纨 张 晶 曹鹏飞 李 娅 孙建慧 陈天鸽 王彩云 李博林(河北省中医院，河北 石家庄 0500)

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性炎症性疾病，病变主要累及结肠、直肠黏膜和黏膜下层。本病周期长，可多次反复，迁延难愈。UC的发病原因和机制仍有诸多不明，目前多数认为是几种因素共同影响而引起肠道黏膜免疫功能紊乱所致〔1〕。其中备受瞩目的便是以细胞因子介导的诸多信号转导通路在炎症性肠病的发病过程中的异常表达〔2〕。中医药治疗UC显示出明显的优势，浊毒内蕴是UC主病机，化浊解毒法是其基本治法〔3〕。基于以上认识，本研究以UC大鼠为载体，以美沙拉嗪作对照，从δ阿片受体(DOR)-β抑制蛋白(β-arrestin1)-Bcl-2信号转导通路探讨兰茵凤扬化浊解毒方治疗UC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 实验动物源自河北医科大学动物实验中心〔SCXK(冀)2013-1-003〕，8周龄雄性 Wistar大鼠60只(体重为 200～250 g、清洁级)。

1.2 主要药物、试剂及仪器 兰茵凤扬化浊解毒方包括佩兰15 g、茵陈15 g、凤尾草15 g、飞扬草15 g、藿香12 g、佛手12 g、胡黄连 12 g、石榴皮12 g、白芍 15 g、儿茶6 g、地榆15 g等，上述药物购自河北省中医院，由其制剂室制成高、中、低三种浓度混悬液(分别为5.00、2.50、1.25 g/ml)。美沙拉嗪肠溶片(佳木斯鹿灵制药有限责任公司，生产批号:140308)。2，4，6-三硝基苯磺酸(美国的Sigma公司);总RNA提取试剂(TaKaRa公司，Code No:9108);PCR反应体系(TaKa-Ra公司，Code No:R004A);cDNA合成试剂盒(TaKa-Ra公司，Code No:62120A);DNA标准(TaKaRa公司，Code No:3427A)。PCR扩增仪PE9600型(美国PE公司);高速冷冻离心机(1-15K，美国Sigma);电泳仪、电泳槽(北京六一)。

1.3 动物模型制备〔4〕所有大鼠先适应性饲养2 w，根据随机数字表随机划分为正常组10只和造模组50只。利用TNBS/乙醇法做UC实验动物模型的准备。模型制备过程中共死亡3只。造模3 d后，从造模组随机抽取大鼠2只，断头处死，予取结肠组织标本处理，确定其标本组织出现了充血、水肿、糜烂及溃疡形成等病理组织学改变，证明造模成功。

1.4 分组与给药 造模组大鼠按照随机数字表分为模型组9只、中药低、中、高剂量组各9只，美沙拉嗪组9只。空白组:常规饲养，不予任何干预;模型组:生理盐水灌胃(4 ml/kg，1次/d);美沙拉嗪组:美沙拉嗪混悬液灌胃(0.3 g/kg，1次/d);中药低、中、高剂量组:分别给予低、中、高浓度兰茵凤扬化浊解毒方混悬液灌胃(5、10、20 g/kg，1 次/d)。连续给药 2 w。

1.5 标本采集和处理 用药2 w后，每组大鼠24 h禁食不禁水处理，称重后，予断头处死。在病变最明显部位(距肛门8 cm处)取2块1 cm×1 cm标本，生理盐水冲洗干净，使无残留物，用冷冻管封存其中1块组织并迅速放入液氮中保存，后移入－80℃冰柜保存。另一块组织予常规石蜡包埋、HE染色处理。

1.6 观察指标 ①疾病活动指数(DAI)评分:参照文献〔6〕中的DAI评分标准。DAI=(便血分数+大便性状分数+体质量下降分数)/3。②结肠黏膜组织病理学观察。③RT-PCR检测结肠组织中β-arrestin1、DOR、Bcl-2 mRNA表达情况

1.7 统计学方法 使用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 DAI评分比较 空白组 DAI评分为(0.00±0.00)分;模型组为(2.46±0.43)分，与模型组比较，中药高、中、低剂量组〔(0.37±0.39)分、(0.81±0.29)分、(1.56±0.41)分〕与美沙拉嗪组〔(0.78±0.29)分〕DAI评分均明显降低(P＜0.05);其中中药高剂量组的DAI评分为最低值(P＜0.05);中药中剂量组与美沙拉嗪组DAI评分无差异(P＞0.05)。

2.2 病理组织学观察 与空白组比较，其余组大鼠结肠黏膜均有大小不同程度的破坏，如炎性细胞浸润、腺体结构被破坏，发生组织充血水肿、黏膜糜烂甚或溃疡等变化。中药高剂量组结肠黏膜结构基本正常，充血水肿不甚明显，仅有少量炎性细胞浸润，与空白组相似。中药低剂量组黏膜仍有破坏，腺体结构欠规则，较明显的组织充血水肿，且有不少炎性细胞浸润，尚可见少量黏膜糜烂及溃疡。美沙拉嗪组、中药中剂量组介于两组之间。

2.3 结肠组织中DOR mRNA与β-arrestin1 mRNA的表达 表1可知，与空白组比较，模型组中大鼠结肠组织的β-arrestin1、DOR mRNA表达水平明显升高(P＜0.05);与模型组比较，各中药治疗组与美沙拉嗪组的β-arrestin1、DOR mRNA表达水平明显下降(P＜0.05)。中药高剂量组表达均低于中药中剂量组、中药低剂量组、美沙拉嗪组(P＜0.05)。与中药低剂量组比较，美沙拉嗪组、中药中剂量组表达水平降低，其差异有统计学意义(P＜0.05)。与中药中剂量组比较，美沙拉嗪组差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 结肠组织中Bcl-2 mRNA的表达 表1可知，与空白组比较，模型组、中药中、低剂量组及美沙拉嗪组大鼠结肠组织中Bcl-2 mRNA表达明显升高(P＜0.05)，中药高剂量组升高无显著性差异(P＞0.05)。与模型组比较，中药高、中、低剂量组及美沙拉嗪组大鼠结肠组织中Bcl-2 mRNA表达明显下降(P＜0.05)。与中药低剂量组比较，中药中剂量组、美沙拉嗪组Bcl-2 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与中药中剂量组比较，美沙拉嗪组Bcl-2 mRNA表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 DOR、β-arrestin1、Bcl-2 mRNA的表达情况()

表1 DOR、β-arrestin1、Bcl-2 mRNA的表达情况()

与模型组比较:1)P＜0.05;与空白组比较:2)P＜0.05;与中药高剂量组比较:3)P＜0.05;与中药中剂量组比较:4)P＜0.05;与中药低剂量组比较:5)P＜0.05

组别 n DOR mRNA β-arrestin1 mRNA Bcl-2 mRNA空白组 10 0.326 6±0.016 81) 0.320 9±0.018 61) 0.321 7±0.023 01)模型组 9 0.531 9±0.023 82) 0.521 7±0.021 52) 0.525 6±0.027 32)中药高剂量组 9 0.347 3±0.011 01)2) 0.344 3±0.014 11)2) 0.335 0±0.014 21)3)中药中剂量组 9 0.391 4±0.024 51)2)3)4) 0.405 2±0.028 91)3)4) 0.379 7±0.023 01)2)中药低剂量组 9 0.451 5±0.020 91)2)3) 0.453 5±0.026 91)2)3) 0.434 9±0.020 31)2)美沙拉嗪组 9 0.373 3±0.019 11)2)3)4) 0.394 1±0.025 61)2)3)4) 0.357 3±0.010 61)2)4)5)

3 讨论

目前，对于UC发生的病因乃至发病机制都不甚清楚。感染、遗传因素、过敏、氧自由基损伤、免疫异常等均与本病的发生发展有密切联系。但是在目前临床观察中，多数研究认为在其多种发病机制中，免疫异常居于核心地位，而造成免疫异常的关键环节就是细胞因子的紊乱，T细胞免疫功能失调所造成的自身免疫异常是UC发生的重要机制。紊乱的细胞因子网络使T细胞在病损的肠道黏膜及固有层大量聚集，活化的T细胞进一步促使炎症细胞分泌，致使结直肠的上皮结构广泛缺失和在固有层发生炎症改变，细胞因子相互作用造成的肠道炎症性改变破坏了肠道黏膜稳态，损伤了肠道屏障作用，这些病理性改变与细胞凋亡和细胞坏死密切相关〔6〕，目前细胞凋亡在结直肠黏膜的缺损及糜烂、溃疡形成中的作用已形成共识〔7〕。越来越多的学者认为感染、遗传、环境等异常可能作为起始因素导致肠道微环境改变，从而使肠道菌群突破肠上皮屏障，异常活化多种信号转导通路，进而以T淋巴细胞为主的炎性细胞因子在肠黏膜内大量释放和聚集，使细胞凋亡抵抗作用加强，肠道免疫稳态遭到破坏，继而导致UC的发生〔8〕。因此，在UC发生的过程中，异常活化的信号通路及其所致的T淋巴细胞凋亡抵抗发挥着重要作用。

在T淋巴细胞的增殖分化过程中，DOR-β-arrestin1-Bcl-2信号通路起到主要作用。该通路下游Bcl-2在调控细胞凋亡基因中起到至关重要的作用，是重要的抗凋亡基因，能够起到抑制细胞凋亡和增殖的作用，Bax是与Bcl-2基因功能完全相反的典型促凋亡蛋白。Bcl-2与Bax分别位于线粒体外膜和线粒体膜，故而其调控凋亡主要作用在线粒体水平，两者保持相对平衡，一旦比例失衡则会引起T淋巴细胞凋亡缺陷，则可能引起肠道发生慢性炎症〔9〕。DOR是跨膜G-蛋白耦联受体(GPCR)广泛存在于神经及免疫系统。β-arrestin1是一种具有多种生物功能的可溶蛋白质，在GPCR信号通路中作为起始信号分子，发挥负性调节作用。其分布在细胞核和细胞质内，是细胞核和细胞质间的信号传递分子，在细胞质内参与GPCR的内化、脱敏，终止GPCR信号通路，参与T淋巴细胞活化过程〔10〕。此外，能够发挥抗凋亡基因作用的Bcl-2即作为靶基因直接受到β-arrestin1的调控。活化的DOR信号诱导CD4+T细胞质内的β-arrestin1信号向细胞核内转移，从而使组蛋白乙酰化酶p300到p27，与cfos增强启动子组蛋白H4乙酰化和Bcl-2基因转录活性，促进Bcl-2的表达，从而抑制UC肠道黏膜CD4+T细胞凋亡〔11〕。本实验结果表明，溃疡性结肠炎大鼠DOR-β-arrestin1-Bcl-2信号通路异常，存在过度表达的Bcl-2抗凋亡蛋白，CD4+T淋巴细胞在肠道组织中的过度聚集，兰茵凤扬化浊解毒方可能通过调控UC大鼠DOR-β-arrestin1-Bcl-2信号通路，从而抑制Bcl-2基因的过度表达，有效减少肠道组织中CD4+T淋巴细胞的过度聚集，从而起到治疗UC的目的。

经查阅古籍，中医本没有UC的病名，但是根据其典型临床表现，在中医病名中，UC可定义为“久痢”、“肠澼”、“休息痢”等疾病范畴。中国古代医学大家多认为本病乃是起于湿阻，平素饮食碍胃，情志失调皆可为病因。本虚标实，病机错杂为UC的主要发病特点。但通过长期大量的临床观察，可发现本病的基础病机是浊毒内蕴，也是本病缠绵难愈的关键因素。浊毒为病的机制可归纳为“易耗气伤血、由血入络，易停滞气机、胶滞不分，易积累成形、败坏脏腑”等三易四性的特点〔12〕。本病初期实证居多，浊毒壅结于肠，致气血搏结，肠络受损，血痈肉溃化脓，本期当以化浊解毒为主给予治疗;后期及缓解期多虚实夹杂证或虚证，在祛除浊毒之邪的同时兼顾补虚。虽然每个阶段的治法有异，但以化浊解毒为基础治法贯穿治疗过程的始终。虽然本病病位位属大肠，但是与脾胃生理功能关系密切。UC在临床中的典型症状以腹痛、腹泻、里急后重和黏液脓血便为主，常常伴随体重减轻、呕吐，偶见关节炎和虹膜睫状体炎等其他病变。而兰茵凤扬化浊解毒方的方义便是以藿香、佩兰芳香醒脾、脾悦化浊止呕，调理气机，凤尾草味苦性寒凉，有清热利湿，凉血止血，解毒止痢之功，飞扬草亦酸寒，除清热解毒利湿，又具收敛之功，四药合功，共奏化浊解毒之效而为君药;茵陈本性寒，有清热利湿的作用，现代药理研究又因为其挥发油对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌等有明显的抑制作用，故佐助化浊解毒之力;地榆苦寒清热，入血分而凉血止血，散血热而疗疮解毒，祛瘀生新，配合乌梅、石榴皮治疗赤白下痢，不仅能收敛抗菌，又能抗炎止血，凉血涩肠;仙鹤草苦涩性平，除凉血止血有奇效外，亦能健脾补虚和胃，作健脾止痢之效;白芍调和血气、缓急止痛;佛手、厚朴理气则后重自除;儿茶生肌敛疮。诸药合用，浊邪化、毒邪清，气血调和、脏腑有序而诸症愈。

本研究表明，经兰茵凤扬化浊解毒方治疗后，大鼠体质量、粪便性状、黏液脓血便等一般临床情况均得到有效改善，镜下结肠黏膜亦得到较好恢复，其中DOR、β-arrestin1及Bcl-2 mRNA在本实验中的表达水平有明显下降。因此，兰茵凤扬化浊解毒方可能通过调控DOR-β-arrestin1-Bcl-2信号通路中异常活化环节的表达，增强肠道黏膜中T细胞的凋亡，恢复肠道免疫稳态而起到治疗UC目的。