Gli通过PI3K/AKT途径促进食管腺癌OE33细胞上皮-间质转化

杜媛鲲 米 源 廖海江 王 雷 (河北医科大学期刊社，河北 石家庄 05007)

食管癌分为食管鳞癌和食管腺癌两种病理类型，近年来，我国虽然以食管鳞癌为主，但随着人们生活水平的提高，食管腺癌的发病率呈上升趋势〔1〕，全世界新增食管腺癌病例中有18%来自中国〔2〕。早期食管腺癌无明显症状，当确诊时多数已发生侵袭转移，即使采取以手术为基础的放化疗综合治疗，五年生存率并没有显著提高。因此，应进一步了解食管腺癌的生物学行为，为食管腺癌的治疗提供新的依据。Hedgehog(Hh)信号通路是近年来肿瘤领域研究热点之一，与肝癌〔3〕，胰腺癌〔3〕、肺腺癌〔4〕、前列腺癌〔5〕等多种肿瘤的发生、发展和转移关系密切，其中Gli作为Hh通路下游的核心组分在信号传导中发挥核心调控作用，但其在食管腺癌中发挥的分子调控机制尚未完全阐明。

脂磷酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号传导通路与肿瘤的侵袭、转移相关〔6〕，并且近年来研究发现在多种肿瘤中Hh信号通路可通过与PI3K/AKT信号通路交叉调控促进肿瘤进展〔7～9〕，但在食管腺癌组织中Hh信号通路是否通过PI3K/AKT信号通路发挥作用及如何影响该信号通路尚缺乏有效证据。本实验通过研究人食管腺癌细胞系OE33中Gli表达和PI3K/AKT通路的相互关系，初步探讨肿瘤的转移机制，为食管腺癌的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 人食管腺癌细胞系OE33购自英国Sigma-Aldrich公司，GANT61购自美国Selleckchem公司，N-Shh蛋白购自美国EBioscience公司，RPMI1640培养液购自美国Corning公司，胰酶胎牛血清购自美国Gemini公司，Mini-PROTEAN TGX预制胶Taqman基因表达预混液购自美国应用生物系统公司，Gli1引物及探针、Gli2引物及探针、β-catenin引物及探针、NCadherin引物及探针、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物及探针购自美国生命技术公司，蛋白酶抑制剂购自德国罗氏公司，M-PER培养细胞总蛋白提取试剂、Pierce-BCA蛋白分析试剂盒购自美国赛默飞公司，Tris/甘氨酸/电泳缓冲液购自美国伯乐公司，电化学发光(ECL)试剂购自美国Thermo-Pierce公司，β-catenin鼠抗人单克隆抗体Gli1兔抗人多克隆抗体购自美国abcam公司、AKT兔抗人单克隆抗体和p-AKT兔抗人单克隆抗体(Ser473)购自美国cell signaling公司，Gli2鼠抗人单克隆抗体、N-Cadherin兔抗人单克隆抗体和GAPDH鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，总RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，cDNA合成试剂盒。

1.1.2 主要仪器 NanoDrop 8000全光谱紫外-可见光分光光度计(美国Thermo Scientific公司)，ELX800多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，ABI 7900HT高通量荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(美国应用生物系统公司公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 OE33细胞均培养于10%胎牛血清、青-链霉素各100 mg/ml的RPMI1640培养液培养基中，于恒定湿度95%、恒定温度37℃、5%CO2培养箱中孵育。

1.2.2 实时荧光定量PCR法 将培养瓶中对数生长期生长状态良好的细胞经0.25%胰酶消化，离心和细胞计数后以每孔0.1×106铺于12孔板，待第2天细胞培养至70%～80%融合时，更换无血清培养基并加入GANT61(15 μmol/L)，同时设 N-Shh 组(0.5 mg/ml)、GANT61＆N-Shh 组 (15 μmol/L GANT61 处理细胞30 min后0.5 mg/ml N-Shh处理细胞24 h)和二甲基亚砜(DMSO)组(对照组)，以上方法处理细胞24 h后按照总RNA提取试剂盒说明书方法提取RNA，将样本经NanoDrop 8000全光谱紫外-可见光分光光度计检测总RNA浓度，按cDNA反转录试剂盒说明书进行cDNA反转录，然后用无R-Nase水稀释10倍后于每孔加 cDNA 4.5 μl、Gli1、Gli2、β-catenin、N-Cadherin 和GAPDH各自的引物及探针0.5 μl及Taqman基因表达预混液 5 μl，反应体系共计 10 μl/孔，加样在 384 孔板上，于 PCR 仪中在 95℃、10 s，60℃、10 s，72℃、10 s的反应条件下进行PCR检测，共40个循环。采用2－ΔΔCt法计算各组mRNA相对表达水平。实验重复3次。

1.2.3 Western印迹 同样方法设GANT61组，N-Shh组、GANT61＆N-Shh组和DMSO组。24 h后常规收集每组样本的总蛋白提取液，BCA法测定样本的总蛋白浓度。在Mini-PROTEAN TGX预制胶中以10 μg每道蛋白上样，在200 V、40 min的反应条件下经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)进行电泳。冰水浴聚偏氟乙烯(PVDF)膜转膜。TBST洗膜，5% 脱脂奶粉/TBST液封膜1 h，加入一抗，一抗工作液浓度:Gli1(1∶1 000)，Gli2(1 ∶250)，β-catenin(1 ∶10 000)，N-Cadherin(1 ∶250)、p-AKT(1 ∶1 000)，AKT(1 ∶1 000)，GAPDH(1 ∶20 000)，4℃孵育过夜。第2天更换二抗，二抗工作浓度均为1∶20 000，室温孵育1 h。ECL试剂显色后于暗室X线曝光显影。实验重复3次。

1.2.4 Transwell侵袭实验 将matrigel从－80℃冰箱中取出置于4℃待其融化，按照1∶4比例用培养基稀释后放置于培养箱待固化。实验分为4组:GANT61组、N-Shh组、DMSO组、GANT61＆N-Shh组。收集处理后的OE33细胞吹打为单细胞悬液重悬在无血清培养液中，上室加入包含7.5×104个细胞的细胞悬液100 μl，下室加入含10%血清的培养液500 μl，注意防止大气泡的产生，于细胞培养箱中培养24 h。24 h后经固定、染色后在400倍显微镜下随机选取4个视野，观察穿膜细胞数。本实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析，组间比较采用LSD法。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR结果 Gli1、Gli2、β-catenin、N-cadherin mRNA表达各组间差异均有统计学意义(F=211.273，P=0.000;F=688.096，P=0.000;F=369.842，P=0.000;F=872.859，P=0.000)。其中GANT61作用于 OE33细胞24 h后导致 Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-cadherin(P=0.000)mRNA的表达水平显著低于DMSO组，差异有统计学意义;与DMSO组相比，N-Shh组可以显著上调肿瘤细胞Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-Cadherin(P=0.000)的 mRNA表达水平，差异有统计学意义;与DMSO组相比，GANT61＆N-Shh组可以部分下调肿瘤细胞 Gli1(P=0.001)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和N-cadherin(P=0.000)的mRNA表达水平，差异有统计学意义。GANT61＆N-Shh组与GANT61组相比，Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.002)和 N-Cadherin(P=0.000)的mRNA表达水平增高，差异有统计学意义。见图1。

图1 实时荧光定量PCR检测各基因表达水平

2.2 Western 印迹结果 Gli1、Gli2、p-AKT、β-catenin、N-cadherin蛋白表达各组间差异有统计学意义(F=492.076，P=0.000;F=2 607.524，P=0.000;F=2 414.111，P=0.000;F=7 669.963，P=0.000;F=2 565.358，P=0.000);AKT蛋白表达各组间没有统计学差异(F=2.190，P=0.167)。GANT61处理OE33细胞 24 h，后 Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.167)和 N-cadherin(P=0.000)蛋白表达均显著低于DMSO组，差异有统计学意义;与DMSO组相比，N-Shh处理组Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和N-cadherin(P=0.000)蛋白表达均显著增高，差异有统计学意义;GANT61＆N-Shh组与DMSO对照组相比可以部分下调Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-cadherin(P=0.000)蛋白表达，差异有统计学意义。GANT61＆N-Shh组与GANT61组相比，Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-Cadherin(P=0.000)蛋白表达均高于GANT61组，差异有统计学意义，见图2。

2.3 Transwell侵袭实验 各组间比较差异有统计学意义(F=1 040.927，P=0.000):与DMSO组穿膜细胞数(154±3.06)比较，GANT61组穿膜细胞数(84±1.53)明显减少(P=0.000)，N-Shh组穿膜细胞数(173±2.00)较 DMSO组明显增多(P=0.000)，GANT61＆N-Shh组穿膜细胞数(106±4.16)较 DMSO组减少(P=0.000)，GANT61＆N-Shh组穿膜细胞数较GANT61组增多，差异有统计学意义，见图3。

图2 Western印迹方法检测OE33中Gli1、Gli2、p-AKT、AKT、β-catenin和N-cadherin蛋白表达

图3 Transwell侵袭实验检测各组OE33细胞侵袭能力

3 讨论

Hh信号通路在胚胎发育、器官成熟的过程中起着非常重要的作用，但当胚胎成熟后此通路将被抑制〔10〕。Hh信号通路的异常激活已证实与许多恶性肿瘤(如胃癌)的发生、侵袭、转移相关〔11，12〕。经典的 Hh通路是过度表达的Shh结合跨膜受体Ptch，解除了Ptch对Smo的抑制作用，使其将信号传递给核转录因子Gli，活化Gli1和Gli2。Gli1是Hh通路重要的转录因子，促进Hh通路下游靶基因的转录表达，其通路的过度激活可引起细胞过度增殖和促进肿瘤细胞侵袭转移。由于Gli在Hh信号通路中发挥着承上启下的核心作用，因此针对Gli为靶点的治疗可以对Hh通路进行精确的调控〔13，14〕。PI3K 在细胞增殖/凋亡等许多细胞进程中起着非常重要的作用〔15～17〕。EMT是肿瘤浸润和转移的重要机制之一，通过EMT过程，上皮细胞失去细胞极性并且细胞之间失去黏附功能，增加了间皮细胞的特性，导致细胞更容易侵袭转移〔18〕。N-cadherin是间质细胞的重要标记之一，在上皮细胞来源的肿瘤中出现N-cadherin高表达是EMT的重要特征，与肿瘤侵袭转移密切相关，可作为判断预后的生物学指标〔19，20〕。β-catenin也被认为是 EMT 过程重要的标记物之一，而且有研究表明肺癌组织中Gli1和βcatenin高表达呈正相关，应用重组Shh蛋白激活Hh通路可以促进肿瘤的侵袭与转移〔21，22〕。Yoo 等〔23〕已发现在胃癌中Shh可以通过激活PI3K/AKT通路促进EMT过程，进而促进肿瘤的侵袭转移。因此，本实验选取Gli1和Gli2的特异性抑制剂GANT61和Shh/Gli通路激活剂N-Shh对食管腺癌细胞进行研究，初步探讨Gli过度表达是否通过活化PI3K通路进而影响食管癌细胞EMT进程并最终导致肿瘤细胞侵袭转移的机制。

本实验结果显示GANT61可以明显下调OE33细胞的Gli1、Gli2基因表达以及EMT重要标记物N-cadherin和β-catenin的基因表达。从蛋白水平检测发现GANT61可以明显下调 Gli1、Gli2 、p-AKT、N-cadherin、β-catenin蛋白表达，AKT蛋白表达没有显著变化。侵袭实验也更进一步证实抑制Gli的表达可以下调食管腺癌细胞的侵袭能力，分析其原因可能是GANT61通过降低PI3K/AKT的磷酸化水平下调EMT进程，而NShh可以明显上调肿瘤细胞的Gli1、Gli2、N-cadherin、β-catenin基因和蛋白表达以及p-AKT蛋白表达，但对AKT蛋白表达没有影响，表明N-Shh可以通过活化Shh/Gli通路上调p-AKT和EMT指标的表达。为了更好理解Shh/Gli通路和p-AKT之间的关系，我们采取了救援实验，既先应用GANT61抑制Gli的表达后再应用N-Shh激活Shh/Gli通路观察相应蛋白的表达，结果显示 Gli1、Gli2 、p-AKT、N-cadherin、β-catenin 等蛋白表达得到部分恢复，说明Shh/Gli通路和PI3K/AKT通路之间是相互关联的，可能是PI3K/AKT信号通路在Shh信号通路调控食管腺癌细胞的EMT过程中可能发挥着重要作用，Gli通过活化PI3K/AKT通路进而上调N-cadherin、β-catenin蛋白表达，促进EMT进程。

综上所述，食管腺癌的EMT过程受多通路、多因子相互调控的作用。本研究初步探讨了Gli在食管腺癌转移中的作用机制，发现在食管腺癌中异常活化的Shh/Gli通路可通过调控PI3K/AKT通路促进EMT过程，进而促进肿瘤的侵袭转移。