白细胞介素-6及叉状头转录因子3在老年口腔鳞癌患者外周血及癌组织中表达及意义

吴 慧 郑根建 何 龙 陶 巍 肖 旭 (海南医学院第一附属医院口腔内科，海南 海口 57023)

口腔癌是世界第六大常见肿瘤，据报道口腔癌每年新发病例26.3万例，死亡近13万〔1，2〕。我国每年新发口腔癌病例近4.65万例〔2〕。目前口腔癌发病原因尚不是十分明确，相关研究表明吸烟、饮酒、口腔卫生差、膳食类型等因素与口腔癌有关，其中多数老年患者由于不良生活习惯，长期吸烟及饮酒导致多种基础疾病，使口腔癌发病的影响更加复杂〔3～5〕。本研究通过检测老年口腔癌组织及外周血中白细胞介素(IL)-6和叉状头转录因子(Foxp)3的表达，探讨其发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年3月至2017年3月海南医学院第一附属医院口腔科门诊治疗并经病理分析确诊的60例原发性口腔癌患者为观察组，术前均未进行过任何的抗肿瘤治疗，并同时选取50例口腔良性肿瘤患者为对照组。年龄60～78岁，平均(69.8±5.1)岁，两组平均年龄差异无统计学意义(P＞0.05);其中观察组发病部位包括舌、牙龈、颊黏膜及口底等，对照组男27例，女23例，两组性别差异无统计学意义(P＞0.05)，研究对象均签署知情同意书。

1.2 样本的收集 于清晨空腹抽取患者外周静脉血3 ml，用于流式细胞术检测。两组手术切除新鲜标本予以固定脱水、石蜡包埋，每例组织进行连续4张切片，切片厚度约为4 μm，并将切片置于预处理的载玻片上，60℃烘箱中放置过夜，以备免疫组织化学染色检测IL-6和Foxp3的表达。

1.3 外周血中IL-6，Foxp3的检测 采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测外周血IL-6浓度。IL-6单抗包被于酶标板上，血清中的 IL-6与单抗结合;加入生物素标记IL-6二抗，在酶标板上形成抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物;加入显色液进行显色处理;用酶标仪测量吸光度值，绘制标准曲线计算血浆中IL-6浓度。步骤如下:浓缩洗涤液用蒸馏水稀释，混匀后备用;将标准品进行稀释，并得到200 pg/ml的高浓度标准品，然后依次稀释为:100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.13，0.00 pg/ml;在酶标板上加入 100 μl标准品及待测样品，每个样品加一个孔;混匀后封住板孔，室温孵育2 h;去除酶标板内液体，并洗涤反应板(每孔内加入300 μl洗涤液)，每次洗涤后完全去除液体，反复洗涤3次;每孔加入100 μl IL-6抗体生物素液，混匀后室温孵育1 h;去除酶标板内液体，并洗涤反应板(每孔内加入300 μl洗涤液)，每次洗涤后完全去除液体，反复洗涤3次;每孔加入 100 μl酶联结合液，混匀后室温孵育30 min;去除酶标板内液体，并洗涤反应板(每孔内加入300 μl洗涤液)，每次洗涤后完全去除液体，反复洗涤3次;每孔加入 100 μl显色液，混匀后室温孵育30 min;反应完成后，在每孔中加入 50 μl终止液，混匀，在酶标仪上读取吸光度值;绘制标准曲线;将待测样本的吸光度带入标准曲线对应的方程中，计算待测样本的浓度。外周血中Foxp3的检测步骤同上。

1.4 组织切片中IL-6，Foxp3的检测 将组织切片至于68℃烤箱30 min，再行脱蜡处理，梯度酒精脱水:二甲苯孵育5 min，加入新的二甲苯继续孵育5 min，无水乙醇洗涤3 min，95%乙醇洗涤3 min，80%乙醇洗涤3 min，而后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3 min;以柠檬酸钠为修复液进行热修复，将载有玻片的盒子置入高压锅内电磁炉加热至沸腾煮5 min后，停止加热，并冷却至室温;甲醇-H2O2溶液予以避光修复20 min，PBS洗涤3次，每次3 min;按照1∶500的比例加入IL-6抗体，对石蜡组织切片进行室温孵育1 h或者4℃孵育过夜，之后用1×PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min;按照 1∶1 000的比例加入辣根过氧化物酶(HRP)二抗，对石蜡组织切片进行室温孵育40 min，之后用PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min;加入二氨基联苯胺(DAB)试剂盒中的显色剂，室温孵育 5～10 min，然后清水冲洗;再进行苏木精复染室温孵育3～5 min，清水冲洗;对染色后的切片进行梯度酒精水化处理，然后树胶封片观察。采用上述同样的操作方法，对组织切片中的Foxp3进行免疫组织化学染色观察。

1.5 结果的判定 Foxp3表达阳性的细胞，通过免疫组织化学染色，细胞核内有棕黄色颗粒;IL-6表达的阳性细胞，细胞质或细胞膜内可观察到棕色颗粒。以PBS代替一抗，进行正常人群口腔黏膜上皮组织的免疫组织化学染色为实验的阴性对照组，以ELISA试剂盒中的阳性染色结果，作为实验的阳性对照组。在400×的视野下，随机选取5个视野，并对这5个视野中的细胞总数以及阳性细胞进行计数。

1.6 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行t、χ2检验，相关性检验采用Spearman分析。

2 结果

2.1 外周血中IL-6、Foxp3表达水平的比较 观察组外周血中IL-6平均浓度显著高于对照组(P＜0.05);Foxp3在对照组外周血中平均浓度显著低于观察组(P＜0.05)，见表 1。

2.2 多水平检测口腔癌患者外周血中IL-6、Foxp3的表达 IL-6浓度在男性和女性患者及有无吸烟史者表达差异无统计学意义(P＞0.05);不同的TNM分期阶段，IL-6浓度差异有统计学意义(P=0.032)，Foxp3浓度在男性和女性患者中有无吸烟史的患者中差异无统计学意义(P＞0.05);Ⅲ/Ⅳ期患者Foxp3浓度显著高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P=0.001)，见表2。

表1 两组外周血中IL-6，Foxp3浓度比较(，μg/L)

表1 两组外周血中IL-6，Foxp3浓度比较(，μg/L)

组别 n IL-6 Foxp3对照组 50 1.72±0.28 23.78±3.56观察组 60 4.83±1.37 41.22±4.17 t值P值15.67＜0.05 23.32＜0.05

表2 多水平比较口腔癌患者外周血、口腔组织中IL-6、Foxp3的表达(，μg/L)

表2 多水平比较口腔癌患者外周血、口腔组织中IL-6、Foxp3的表达(，μg/L)

因素 n 外周血口腔组织(n)IL-6 P值 Foxp3 P值IL-6表达 P值 Foxp3表达 P值性别 男 33 4.79±1.32 0.871 40.37±3.98 0.103 17 0.262 17 0.755 27 4.85±1.53 42.13±4.23 10 15吸烟史 有 38 4.85±1.42 0.635 41.89±4.27 0.412 19 0.306 19 0.496无 22 4.67±1.38 40.97±3.94 8 13 TNM 分期 Ⅰ/Ⅱ 39 4.52±1.51 0.032 39.26±3.86 0.001 12 0.003 17 0.039Ⅲ/Ⅳ 21 5.37±1.27 43.17±4.31 15 15女

2.3 口腔癌患者外周血中IL-6与Foxp3的相关性口腔癌患者外周血中IL-6表达平均水平为(4.83±1.37)μg/L，Foxp3表达平均水平为(41.22±4.17)μg/L，两者表达呈正相关(r=0.40，P＜0.05)，见图1。

2.4 各组口腔组织中IL-6，Foxp3表达阳性率比较IL-6阳性表达率两组比较差异有统计学意义(P＜0.01);Foxp3在两组中表达差异有统计学意义(P＜0.01)，见表 3、图 2。

图1 口腔癌患者中IL-6与Foxp3呈正相关

表3 两组口腔组织中IL-6，Foxp3表达阳性率比较〔n(%)〕

图2 两组口腔组织中IL-6、Foxp3免疫组织化学染色结果(DAB，400×)

2.5 多水平检测口腔癌患者癌组织中IL-6，Foxp3的表达 在口腔癌患者组织中IL-6、Foxp3阳性表达率在男性和女性患者中、有吸烟和无吸烟的患者中差异无统计学意义(P＞0.05);不同TNM分期阶段，IL-6、Foxp3的阳性表达率差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.6 口腔癌患者癌组织中IL-6与Foxp3的相关性IL-6与Foxp3阳性表达呈正相关(r=0.38，P＜0.05)。

3 讨论

口腔鳞状细胞癌是最常见的口腔恶性肿瘤，其恶性程度高、进展快、预后效果较差，易侵犯周围邻近组织，且淋巴结转移率较高，预后较差〔6，7〕。由于早期症状不很明显，导致许多患者在就诊时已经处于中晚期，并且发病也主要发生于40岁以上的中老年人〔7〕。老年口腔癌患者其主要表现在诸多老年患者饮酒、吸烟等不良口腔生活习惯较久，暴露于烟草、酒精等其他危险因素的时间也较长，与年轻口腔癌患者相比其发病因素也更复杂〔3，4〕。研究指出，对口腔癌患者进行早诊断早治疗，可有效改善其预后〔7〕。在癌症中寻找相关特异性的蛋白标志物及相关生化指标，尤其在口腔癌患者组织或血清中寻求肿瘤标志物对口腔癌的早诊断治疗及对患者预后具有重要的临床应用价值〔8～10〕。

IL-6是一种多功能细胞因子，在机体参与肿瘤免疫过程中具有影响肿瘤细胞增殖、分化的作用〔11〕。研究发现，胆管癌患者血清IL-6水平显著增高，且与患者预后具有相关性，提示IL-6水平异常或许会引起胆管上皮的增殖改变，从而诱导肿瘤发生和发展〔8〕。Wei等〔9〕发现宫颈癌组织中 IL-6的表达明显增高，提示肿瘤细胞产生的IL-6可能作用于宿主并参与肿瘤血管的形成，改变组织局部的免疫机制，引发肿瘤细胞进一步增殖、分化〔9〕。本研究与先前国外学者研究结果一致，暗示着口腔癌组织中合成分泌IL-6的能力增强与口腔癌的发生密切相关〔10〕。

Foxp3在Treg细胞的发育及调控中起重要作用，Foxp3分子通过发挥强烈的抑制抗肿瘤免疫功能，从而导致肿瘤免疫逃逸的发生，视为判断肿瘤患者生存期和预后的一个重要指标〔12～14〕。研究表明，Foxp3基因沉默的细胞株具有显著减弱 T细胞增殖的抑制作用，提示Foxp3可通过某种作用机制来影响效应性T细胞免疫功能〔12〕;研究还发现，Foxp3基因表达具有明显降低沉默癌细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、IL-10表达，表明肿瘤细胞中 Foxp3可能通过影响VEGF及IL-10的表达，参与血管形成及免疫抑制来促进肿瘤发生与发展〔15〕。B细胞经由Th2细胞产生的IL-6促进分化分泌免疫球蛋白(Ig)A，从而显著影响T细胞增殖与分化〔12〕。在肿瘤微环境下，异常表达的IL-6导致体液免疫调节紊乱，进而导致机体免疫调节系统异常〔11〕。细胞毒性T细胞的终末因子IL-6会进一步导致T细胞的增殖与分化发生异常，从而加重对机体的毒性〔14，15〕。肿瘤细胞产生IL-6引发口腔黏膜局部周围组织结构发生破坏甚至重构，促进Foxp3的表达，抑制体内T细胞免疫功能的发挥，从而导致肿瘤进一步发展。