GTP连接蛋白4在肝细胞癌中的表达及临床意义

章诺贝 陈 新 (南昌大学第二附属医院消化内科，江西 南昌 330006)

肝细胞癌(HCC)是全球第五大常见的恶性肿瘤，在我国，HCC的死亡率高居恶性肿瘤死亡率的第2位〔1〕。HCC的发生发展是多因素、多阶段、多基因相互作用的结果，包括病毒感染、致癌物的作用、癌基因激活和抑癌基因失活、细胞凋亡和增殖调节失控等。关于HCC发生发展的确切机制仍有待进一步阐明。GTP连接蛋白(GTPBP)是指能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有GTP水解酶活性的一类信号转导蛋白，由α、β、γ 3个不同亚基组成，其在细胞信号传递转导、细胞骨架形成、蛋白质合成等细胞的多种生命活动中均发挥重要作用〔2〕。GTPBP4编码基因是广泛存在于从酵母到人类各种真核生物中的高度保守基因〔3〕。近来有研究报道，GTPBP4表达减弱可使人结肠癌细胞的增殖受到抑制，而GTPBP4的表达升高又与结肠癌和乳腺癌患者生存率下降有关〔4，5〕。本文拟分析GTPBP4在HCC发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床样本

1.1.1 新鲜HCC组织标本 于2015年4～11月在南昌大学第二附属医院手术切除的新鲜HCC组织标本25例，标本均包含HCC组织及距癌灶距离≥2 cm的无瘤正常肝组织。术中切除后30 min内立即将标本置入液氮罐中，随后于－80℃冰箱中储存待用。

1.1.2 HCC组织芯片 75例HCC组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司，人HCC组织芯片编号:HLiv-HCC150CS-02。HCC的大小、数目、血管侵犯、淋巴结侵犯和有无远处转移的描述主要借鉴国际抗癌联盟/美国肿瘤联合会(UICC/AJCC，2010)标准。肝癌的病理分级运用Edmondson-Steiner四级法表示〔6〕，Ⅰ级:癌细胞与正常肝细胞相似，细胞质呈嗜伊红，并偶见胆汁小滴;细胞核圆且规则，核仁明显，分裂相较少，核质之比接近正常，细胞排列成条索状，索梁间血窦明显、清晰，并衬以单层内皮细胞。Ⅱ级:癌细胞略异形，细胞质内颗粒较为明显，细胞核体积较大，核质比例增大;细胞核染色深浅不一致，核仁较明显，分裂相较多，常见腺泡状排列。Ⅲ级:癌细胞异形明显，胞质嗜苏木素，胆汁小滴少;细胞核体积大，而且形态不规则，细胞核染色质较粗，且染色质分布紊乱，核仁较多，且显示明显，并呈现瘤巨细胞。细胞排列分布不规则，细胞分裂相多。Ⅳ级:癌细胞形态变异明显，见多量梭形细胞，细胞排列极度紊乱，无结构形态;细胞质少，而细胞核大，核仁形态极度不规则。其中，男63例，女12例;年龄34～77岁，平均52岁;肿瘤大小:≤6 cm 36例，＞6 cm 30例，9例缺失;HCC病理分级:Ⅰ、Ⅱ级49例，Ⅲ、Ⅳ级26例;T(原发灶)分期:T1(孤立肿瘤没有血管受侵)、T2(孤立肿瘤，有血管受侵或多发肿瘤直径≤5 cm)44例，T3(孤立肿瘤或多发肿瘤侵及门静脉或肝静脉主要分支或多发肿瘤直径＞5 cm)、T4(肿瘤直接侵及周围组织，或致胆囊或脏器穿孔)26例，5例缺失;无淋巴结转移(N0)69例，有区域淋巴结转移(N1)5例，1例缺失;无远处转移(M0)70例，有远处转移(M1)5例。

1.2 方法

1.2.1 新鲜组织标本GTPBP4 mRNA检测 分别将约0.1 g的HCC及癌旁正常肝组织块置入已由焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理并加有液氮的研钵内，迅速将组织块碾压成至粉末状。依照Invitrogen公司的Tr-izol试剂操作说明书进行总RNA抽提。为了测量GTPBP4的mRNA水平，使用Sensiscript RT试剂盒将总RNA逆转录成 cDNA，使用 SYBR Green PCR Master Mix在ABI Prism 7900序列检测系统上进行qRT-PCR反应。用于扩增GTPBP4的正向引物:5'-TCA GGA TCC GCT AAG CCC CAG GTG GTT-3';反向引物:5'-GGC TCG AGT TAC TGT TTT CGC TTA CG-3'，以GAPDH作为参照物。

1.2.2 组织芯片的GTPBP4免疫组化检测 GTPBP4抗体稀释比例为1∶6 000，以磷酸盐缓冲液(PBS)做阴性对照，免疫组织化学采用SP法:烤片，68℃，20 min。常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水;二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、100%酒精10 min、100%酒精10 min、95%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min。阻断灭活内源性过氧化物酶:3%过氧化氢(H2O2)37℃孵育 10 min，PBS冲洗 3×5 min。抗原修复:置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)中用煮沸(95℃，15～20 min)，自然冷却20 min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3×5 min。正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗。滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3×5 min(用PBS代替一抗作阴性对照)。滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min。二氨基联苯胺(DAB)/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。使用HCC组织芯片进行实验对产生的所有GTPBP4抗体表达的原始实验数据进行判读，判读GTPBP4的胞质或胞膜染色强度(0/1+/2+/3+)和染色阳性率，癌组织和癌旁组织(上皮)分别判读。染色强度评分:0分(阴性)，1分(1+)，2分(2+)，3分(3+)。染色阳性率评分:0分(阴性)，1分(1%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(76%～100%)。以染色强度评分和染色阳性率评分的乘积为总评分，≤3分为抗体低表达组，＞3分为抗体高表达组。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件进行t检验、Wilcoxon检验，非参数 Mann-Whitney法及 Log-rank检验。

2 结果

2.1 GTPBP4 mRNA在HCC组织和癌旁组织中的表达 25例组织标本中，HCC组织中GTPBP4 mRNA表达(8.201±1.228)显著高于癌旁组织(4.357±1.305，P=0.000 2)。其中HCC组织中表达上调18例，变化不明显4例，表达下调3例。

2.2 GTPBP4蛋白在HCC组织和癌旁组织中的表达在HCC组织芯片中，HCC组织中GTPBP4蛋白表达水平〔胞质(8.100±1.926)、胞膜(1.973±3.594)〕显著高于癌旁组织(6.567±2.315、0.000±0.000，Z=－4.551、－3.810，均 P=0.000)，见图 1。

2.3 GTPBP4在HCC中的表达水平与临床病理参数的关系 病理分级Ⅲ、Ⅳ级患者HCC胞膜GTPBP4表达水平显著高于病理分级为Ⅰ、Ⅱ级(P=0.034)。不同年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期患者HCC中GTPBP4表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

图1 GTPBP4的免疫组化图片(DAB，×400)

表1 GTPBP4在HCC中的表达水平与临床病理参数的关系(n)

续表1 GTPBP4在HCC中的表达水平与临床病理参数的关系(n)

2.4 GTPBP4表达水平与HCC患者预后的关系GTPBP4胞膜高表达组的生存率显著低于低表达组，差异有统计学意义(χ2=6.049，P=0.014)，见图 2。

图2 不同GTPBP4表达水平HCC患者生存曲线

3 讨论

据统计，我国每年有约30万的HCC患者死亡〔7〕。HCC的平均生存期仅为4～6个月〔8〕。患者确诊时多数已进入中晚期，失去了手术治疗的机会，即使能够手术，患者术后2年内复发率约为50%，5年生存率仅为25%～39%〔9～11〕。HCC 的治疗方法主要包括:根治性肝癌切除术〔12〕、肝动脉化疗栓塞术(TACE)〔13〕、肝癌射频消融〔14〕、无水乙醇瘤内注射术(PEI)〔15〕、分子靶向药物(如索拉非尼)〔16〕、肝脏移植等，但总体治疗效果均不尽人意。因此，探明HCC发生发展的确切分子机制，设计合理化、个性化药物具有极其深远的意义。

人类GTPBP4基因位于染色体10p15.2～15.3，其编码635个氨基酸，与鼠、兔的GTPBP4基因同源体均保持93%的同源性，其中一个与GTP结合的超二级结构GYPNVGKS在酵母、鼠类及人类中均保持一致〔17〕。此前，因发现其在慢性肾脏病中表达发生改变，故也曾被称为慢性肾衰竭基因(CRFG)〔17〕。GTPBP4在核糖体60S的生物发生过程中发挥关键作用〔18〕。研究发现，将GTPBP4在酿酒酵母中的同源体敲除后酿酒酵母也随之停止生长，提示GTPBP4可能与细胞的生长有关〔17〕。

本研究表明，GTPBP4的表达水平与HCC患者的病理分级有关。而Edmondson-Steiner肝癌分级可显著提高对HCC患者生存期的预测效果〔19〕。另外，本研究表明，GTPBP4表达水平与患者预后相关，并提示GTPBP4为HCC相关基因，其可能与HCC的发生发展有关。GTPBP4是否可作为HCC早期诊断的靶蛋白，针对GTPBP4的靶向治疗也许能成为HCC治疗的一个新靶点。