COL9A2基因野生型与G143C、G884A突变型质粒构建及鉴定

陈蓉，罗家明，张微，胡为民，杨健，朱红

(1.川北医学院微生物学与免疫学教研室；2.川北医学院附属医院神经内科；3.川北医学院临床医学院，四川 南充 637000)

COL9A2 基因又名IX型胶原α2(collagen type IX alpha 2 chain)，为胶原类(collagen)基因家族中1员，位于1p34.2。整个基因组大致包括32个外显子，大小约2 889 bp，翻译的蛋白质大概有689个氨基酸，蛋白质大小约65 131 Da。COL9A2 基因系蛋白编码基因，编码IX型胶原蛋白，主要编码IX型胶原α2链，其为1个共价键连接的糖胺聚糖侧链。胶原类基因主要编码细胞外基质胶原成分，眼巩膜由细胞外基质胶原与少量其他细胞组成，其中胶原约占巩膜的90%，胶原减少可能与病理性近视发病密切相关[1]。胶原类基因在眼轴长度变化中发挥重要作用，其主要包括COL9A2基因、COL9A1基因、COL9A3基因、COL11A1基因、COL11A2基因、COL2A1基因等[2-7]。COL9A2 基因主要表达于巩膜、胸腺、大脑、心肌、骨骼肌、平滑肌等，其中巩膜分布最广泛[8-9]。据报道，COL9A2 基因突变或许会减少巩膜组织中的胶原成分，从而使眼轴延长，导致病理性近视[10]。

本研究团队应用Sanger测序，在病理性近视患者中检测到COL9A2 基因2个突变位点，即G143C、G884A杂合突变[11]。为探寻COL9A2 基因突变型G143C、G884A是否与病理性近视的发病有关，本研究运用基因工程技术进行人COL9A2 基因克隆和序列分析，应用定点突变法，构建COL9A2 基因野生型和突变型G143C、G884A的真核表达质粒，并进行鉴定。有望为COL9A2 基因功能研究提供帮助，为进一步探索病理性近视的发生、发展机制，研发病理性近视早期诊断方法及治疗措施奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 限制性内切酶HindⅢ(北京博凌科为生物科技有限公司)，BamHⅠ (上海纯优生物科技有限公司)，T4 DNA连接酶(大连宝生物工程有限公司)，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，DNA molecular marker(Thermo Fisher Scientific)，模板DNA由四川省人民医院分子遗传中心赠予，定点突变试剂盒(赛默飞世尔科技公司)。

1.1.2 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增引物 从美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)基因组数据库网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001852.3) 获得基因序列及酶切位点序列。Primer3 网络辅助设计引物(引物序列见表1)，点突变引物在引物两端分别加入HindⅢ与BstBI酶切位点，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 COL9A2基因野生型与突变型引物序列

1.1.3 菌种与质粒 E.coli DH5α感受态细胞(大连宝生物工程有限公司)，pUC57空质粒(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因保守度分析 在NCBI中的homologene，对COL9A2基因突变位点进行进化保守性分析，网站为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene。

1.2.2 PCR扩增COL9A2基因 共50 μL体系：Pfu DNA聚合酶25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 5 μL，正向引物2.5 μL，反向引物2.5 μL，模板DNA 2.5 μL，Sterilized dd H2O补足50 μL，退火温度61 ℃。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性1 min，不同引物在其相应退火温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，以上反应进行38个循环；完成上述循环后，72 ℃延伸10 min，12 ℃保温。取PCR产物3 μL于1.2% 琼脂糖进行电泳，获得清晰、片段大小正确的COL9A2基因条带[12]。

1.2.3 COL9A2基因克隆 根据定点突变试剂盒说明书操作步骤，诱导定点突变，将COL9A2基因野生型与G143C、G884A突变型插入pUC57-sgRNA expression vector中。pUC57具有氨苄抗性，是大肠杆菌中常用的质粒克隆载体，长度约为2 710 bp，使用标准方法从大肠杆菌DH5α中分离。用HindⅢ和BamHⅠ 对野生型、突变型与pUC57进行双酶切，电泳后，取片段大小正确的产物进行胶回收。胶回收产物用T4连接酶16 ℃ 连接12 h。连接产物电泳，获得清晰、片段大小正确的条带后，将连接产物转化到DH5α感受态细胞，半小时后接种于带氨苄抗性的平板培养基，37 ℃ 培养箱培养过夜[13]。第2天，随机挑选单个菌落，接种于200 mL培养基中，37 ℃ 摇床摇菌过夜，取1 mL菌液送上海生工生物工程股份有限公司进行全基因测序。所测碱基序列与COL9A2基因野生型及G143C、G884A突变型一致后，制备大量质粒，供后续研究使用。

2 结果

2.1 基因保守度分析结果

COL9A2基因突变型G143C的氨基酸位置为p.Gly48Ala；G884A的氨基酸位置为p.Gly295Asp。经homologene进行基因保守度分析，发现COL9A2基因p.Gly48Ala与p.Gly295Asp在不同物种中具有高度保守性，见图1。

2.2 酶切、连接产物电泳结果

COL9A2基因野生型与突变型PCR产物插入pUC57-sgRNA expression vector载体后，用HindⅢ和BamHⅠ 对野生型、突变型与pUC57进行双酶切，1.2%琼脂糖进行电泳，可见一大一小两个片段，与Marker对比，大片段约为5 599 bp，小片段不到1 000 bp，片段大小与目的条带大小相符，见图2。

COL9A2基因大小约2 889 kb，pUC57-sgRNA expression vector大小约2 710 kb，COL9A2基因野生型与G143C、G884A突变型插入pUC57-sgRNA expression vector后连接，连接产物于1.2%琼脂糖进行电泳，连接产物片段大小约5 599，与目的片段大小相符，见图3。

2.3 COL9A2基因野生型与突变型质粒鉴定

菌液送上海生工生物工程股份有限公司进行基因测序。测序检测验证，COL9A2基因野生型碱基序列与GeneBank (Gene ID:1298)上序列完全一致，G143C突变型除143位碱基G被C取代外，其余序列与野生型序列完全一致；G884A突变型除884位碱基G被A取代外，其余序列与野生型序列完全一致。见图4。

3 讨论

COL9A2 基因突变主要与胶原成分含量较高的器官或组织病变相关，胶原含量较高的主要有巩膜、椎间盘等[14]。研究表明COL9A2 基因Gln326Arg突变或许会导致椎间盘病变[2]，COL9A2 基因GCAGCG缺失可能会使椎管狭窄[15]。Hyun等[4]研究发现，COL9A2 基因c.843_c.846缺失突变或许会引起常染色体隐性遗传病Stickler综合，Guo等[16]进一步证实COL9A2 基因突变也许会导致Stickler综合，病理性近视是Stickler综合患者主要临床表现之一。研究显示，COL9A2 基因突变或过度表达或许会使巩膜组织堆积，而影响巩膜结构，导致眼轴延长[17]。眼轴延长是病理性近视主要病理改变之一，且病理近视患者眼轴延长可遗传给下一代[18]。

本研究团队应用Sanger测序技术，对200例病理性近视患者与200名健康者对照的COL9A2 基因全部外显子及其侧翼进行测序检测。在1例病理性近视患者的COL9A2 基因2号外显子检测到G143C(c.143G>C)突变，导致的氨基酸改变为p.Gly48Ala；在另1例病理性近视患者的COL9A2 基因17号外显子检出G884A(c.884G>A)突变，导致的氨基酸改变为p.Gly295Asp，其他病理性近视与健康对照组中未检测到上述突变位点[11]。

经HomoloGene进行基因保守度分析，COL9A2 基因G143C、G884A位点在不同物种中高度保守，说明上述位点突变，可能会导致COL9A2 基因表达异常或功能改变。病理性近视患者中检测到COL9A2 基因G143C、G884A突变位点，由此推测COL9A2基因突变或许是病理性近视发生、发展的危险因素之一。为研究COL9A2基因突变在病理性近视的发病机制中的影响，构建COL9A2基因野生型与突变型质粒是关键。本研究成功构建了COL9A2 基因野生型及G143C、G884A突变型质粒，经Sanger测序检测，序列与预期相符。本研究团队拟行COL9A2 基因功能研究，进一步研究其在病理性近视发病机制中发挥的作用。本研究构建的pUC57-COL9A2基因野生型、pUC57-p.Gly48Ala和pUC57-p.Gly295Asp突变型质粒，为后续研究奠定基础。