国医大师刘尚义养阴药物组合治疗原发性干燥综合征的靶基因生信分析研究

梁江 黄维琛 张大铮 曹正同 邰湾 曾苹 卢云 徐宇 何龙

【摘 要】目的：利用生物信息分析方法預测探索国医大师刘尚义养阴药物组合（北沙参、五味子、

麦冬、天冬）治疗原发性干燥综合征（pSS）的效应靶基因。方法：从BATMAN-TCM中药化合物数据库搜寻刘尚义养阴药物组合所含成分作用的效应基因数据集A，从公共基因芯片数据库GEO筛选符合纳入条件的人外周血、唾液腺或腮腺组织全基因组RNA芯片（因pSS主要破坏外分泌腺，因此选择样本为pSS患者和正常人的唾液腺或腮腺组织、外周血）利用GCBI在线实验室筛选出pSS与正常组织的差异基因数据集B；分别对上述两个数据集及两者的交集通过GCBI进行GO富集分析、KEGG通路分析以及参与生物功能的蛋白相互作用网络分析（PPI分析）。结果：从符合研究纳入条件的3块SS患者与常人血液、唾液腺或腮腺组织基因芯片数据集最终得到含67个差异性基因的数据集（B），从BATMAN-TCM中药化合物数据库查到该药物组合调节基因1293个（A），交集得到该药物组合治疗pSS的潜在靶基因5个（BAFF、Fas、CMPK2、RSAD2、NMI），后续PPI分析及文献回溯证实这5个基因紧密联系，与病毒感染致的免疫反应及细胞凋亡相关，细胞凋亡反应相关通路密切联系，预示该药物组合有可能通过直接或间接调节以BAFF、Fas、CMPK2、NMI等为主的基因或蛋白表达达到抑制pSS进程的效果。结论：利用生物信息学有助于刘尚义教授养阴中药组合成分针对pSS损害靶器官的效应靶基因进行探索，为下一步实验研究指明核心靶点，提供理论依据。

【关键词】 干燥综合征；原发性；养阴药；生物信息分析；腮腺组织；唾液腺组织；刘尚义

Bioinformatic Analysis of Target Gene of Primary Sj?gren's Syndrome Treated by TCM Master LIU Shang-yi

with Combined Chinese Drugs

LIANG Jiang，HUANG Wei-chen，ZHANG Da-zheng，CAO Zheng-tong，TAI Wan，ZENG Ping，LU Yun，XU Yu，

HE Long

【ABSTRACT】Objective：To explore the target genes of primary Sj?gren's syndrome（pSS）treated by TCM master LIU Shang-yi with combined Chinese yin-nourishing drugs such as Beishanshen（Radix Glehniae），Wuweizi（Fructus Schisandrae Chinensis），Maidong（Radix Ophiopogonis）and Tiandong（Radix Asparagus）.Methods：The effect gene dataset A of LIU Shang-yi's combined yin-nourishing drugs was searched from Chinese Medicine Compound Database BATMAN-TCM，and the whole genome RNA microarray of human peripheral blood，salivary gland or parotid gland was screened from GEO database.The GCBI on-line laboratory was used to screen out difference gene dataset B between pSS and normal tissues.The two datasets and their intersection were analyzed by GCBI for GO enrichment，and KEGG pathway analysis and PPI analysis were also done.Results：The data set B of 67 differentially expressed genes was obtained from three gene chip datasets of pSS patients and normal human blood，salivary gland or parotid gland tissue and 1293 regulatory genes（A）were obtained from the BATMAN-TCM.Five potential target genes（BAFF，Fas，CMPK2，RSAD2，NMI）were got from the intersection.PPI analysis and literature review confirmed that these five genes were closely related，and were closely related to the immune response and apoptosis induced by virus infection.Close relation of apoptosis-related pathways indicated that the combined drugs might directly or indirectly regulate the expressions of genes or protein（mainly BAFF，Fas，CMPK2 and NMI）to inhibit the process of pSS.Conclusion：Bioinformatics is helpful for Professor LIU Shang-yi to explore the combined yin-nourishing drugs on pSS damaging target organs，and provide theoretical basis for further experimental research.

【Keywords】 Sj?gren's syndrome；primary；yin-nourishing drugs；bioinformatic analysis；parotid gland tissue；salivary gland tissue；LIU Shang-yi

原发性干燥综合征（primary Sj?gren's syndrome，pSS）是一种以外分泌腺（如唾液腺、泪腺、腮腺为常见好发部位）被大量淋巴细胞浸润为病理特征的自身免疫性疾病，临床症状表现常以口眼干涩、猖獗性龋齿为主，也可见肾脏、关节、血液等系统性损害[1]。本病属中医学“燥证”范畴，病机以阴虚津亏、燥热偏盛为主[2]。北沙参、麦冬、天冬、五味子是国医大师刘尚义针对阴虚津亏证型pSS的常用药物组合，意在益气养阴生津、润燥降火，临证常获良效；但具体机制不明。受中医“以药测证”思路启发，本研究拟从该药物组合成分调节的基因群、pSS与正常人唾液腺或腮腺组织差异性基因进行交集、生物信息分析，探索该药物组合治疗pSS的潜在靶基因，为后续靶点实验研究提供依据。

1 数据来源

1.1 刘尚义教授养阴药物组合调控基因数据集A的获取 在中药成分干预基因数据库BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中依次

输入该药物组合中每味药物的汉语拼音名称：Bei shashen（即北沙参，CoasiaI GIehnia Root，为伞形科植物珊瑚菜的根）；Maidong（即麦冬，dwarf lilyturf tuber，百合科植物麦冬块根）；Tiandong（即天冬，Cochinchinese asparagus root，百合科植物天冬块根）；Wuweizi（即五味子，Chinese magnoliavine fruit，木兰科植物五味子果实）。检索每种药物化学组分及该组分调节的基因，筛选出积分 > 20分、P < 0.05的基因，删除同名重复项取并集，得到以上药物组合组分调节靶基因数据集A。

1.2 pSS患者与正常人唾液腺或腮腺组织、外周血差异性基因数据集B的获取 在公共基因数据库GEO（Gene Expression Omnibus，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载pSS患者与正常人唾液腺或腮腺、外周血比较研究RNA芯片数据。每个芯片数据集均需符合以下条件：①数据集来自全基因组RNA表达芯片；②因唾液腺为pSS好发部位，且是常规诊断性活检取材部位，故选用pSS患者以及正常人的外周血、唾液腺或腮腺组织进行对照，每组样本量≥ 3个；③GCBI平台（Gene-Cloud of Biotechnology Information，http：//www.gcbi.com.cn）支持这些芯片数据的后期运算分析，将从GEO下载的原始芯片数据导入GCBI平台，按照其生物信息分析模块构建分析路线图（如图1）进行自动运算分析，获得多个研究中正常人组织（记为C组）和pSS组织（记为P组）的差异基因并取得交集差异基因（若差异基因少于10，则取并集），先进行唾液腺研究芯片交集，再与腮腺、血液芯片进行交集。

1.3 分析方法 在GCBI平台依次针对基因数据集B中差异基因的功能和生物过程进行基因分类注释功能富集分析（GO分析），信号通路富集分析（KEGG分析）以及差异基因编码蛋白的相互作用网络分析（PPI分析）。以上分析取前10项最显著的条目，不足10条者罗列全部条目。基因数据集A在BATMAN-TCM数据库中自动完成上述过程，可供查阅，A、B取交集后将基因名输入STRING网站（https：//string-db.org）进行PPI分析并得到图。

2 结 果

2.1 刘尚义教授养阴药物组合调节的潜在靶基因数据集 在BATMAN-TCM数据库中查到各药物满足纳入条件、有调节基因记录药物组分情况如下：北沙参有效组分6个，这些组分调节的146个基因主要参与细胞糖酵解、脂肪酸、嘌呤、半胱氨酸代谢，与细胞凋亡相关；天冬有效组分5个，这些组分调节的387個基因主要参与了嘧啶、叶酸、脂肪酸代谢和钙离子通道调节，可能与外分泌功能相

关；麦冬有效组分18个，这些组分调节的236个基因参与精氨酸和脯氨酸代谢、细胞色素代谢、神经腺体与受体互相作用等过程；五味子有效组分72个，调节基因930个，涵盖了前面3味药调节的部分基因，这些基因功能复杂多样，参与了激素合成、视黄醇、络氨酸及多种氨基酸代谢，参与了钙离子通道、多巴胺能神经突触等与SS相关的信号通路调节，扣除单味药物共同调节的基因（重复部分），该药物组合共调节1293个基因。

2.2 pSS患者与正常人腺体组织（含唾液腺或腮腺组织）、外周血差异性基因数据集 在GEO数据库中检索得到以下3块符合条件的芯片

首先对原始芯片数据进行芯片信号值的预处理与预过滤，然后使用差异分析方法SAM法，依次对所纳入的4块芯片数据进行差异基因的筛选。唾液腺标本组差异基因的筛选条件为：P < 0.05，差异倍数≥1.2倍，其中从GSE23117中获得差异性基因6个，从GSE07451中获得差异性基因204个；

从GSE40611中获得差异性基因6455个，从GSE84844中获得差异性基因6892个；因唾液腺组织为pSS主要损害靶器官，而样本较少，两块基因芯片的差异性基因差别太大，故GSE23117、GSE07451中的数据先取并集再同腮腺的芯片差异性基因取交集得到98个基因；再次与外周血液样本差异性基因取交集最终得到67个基因（即同时表达在外周血、腮腺、唾液腺组织中pSS患者与正常人的差异性基因，即基因数据集B）。

2.3 同时表达在外周血、腮腺、唾液腺组织中pSS患者与正常人的差异性基因生信分析结果

2.4 基因数据集A、B交集基因的PPI分析结果 A、B两个数据集交集得到Fas[又名肿瘤坏死因子家族成员6（TNFRSF6）]，胞苷酸激酶2（CMPK2），TNFSF13B（又名BAFF，B细胞激活因子），NMI（N-Myc and STAT interactor），即（N-Myc与STAT耦合子），激化S-腺苷蛋氨酸包含域2（RSAD2）共5个基因，经扩展相关基因范围后，PPI分析结果见图3（圆点表示基因，连线表示关联性，连线越多，表示作用关系越多，越紧密），适度扩增周围蛋白范围后，可见以上

5个基因与导致细胞凋亡的胱天蛋白酶8（CASP8），丝裂原活化蛋白激酶5（MAP3K5）联系较密切，相互之间也有间接和直接作用，Fas、BAFF（即图中的TNF13B）是与周围基因相互作用关系较多的基因，CMPK2与其周围蛋白自成一套互相作用网络，但与NMI、BAFF、Fas无密切关联。而RSAD2未见与周围基因明显关联，较为孤立。

3 讨 论

pSS是一种以唾液腺、泪腺、腮腺等外分泌腺被淋巴细胞侵袭导致分泌功能减低为病理特征的常见风湿病，因此唾液腺、腮腺活检是本病诊断的金标准，本病常引起患者口眼干涩、吞咽干性食物困难症状，更可导致血液、关节、肺等多组织损伤[3]。本病属中医学“燥证”“燥痹”范畴。众多医家受《黄帝内经》论述“燥胜则干”启发，以养阴润燥、益气生津为主要治法[4]。刘尚义教授起初发现北沙参、天冬、麦冬、五味子4味养阴药配伍可改善肿瘤放疗、化疗患者口干、舌燥症状，进而推论此药物组合与pSS患者“阴虚津亏”的病机切合：本病典型证候“口眼干涩，舌红无苔，脉多细而无力”为肺阴亏虚，虚火上灼，津液无以上承濡养所致，当给予养阴生津为要，经临床验证疗效满意。北沙参，性寒，味甘苦，归心、肺经，按《本草逢源》要义，肺热用沙参，专取泄热养阴之功，则虚热得清，“津液复而正气受益”。天冬、麦冬均为百合科植物，性寒，味甘苦，天冬入肺、肾经，《长沙药解》评价其功在“清金而生水”；麦冬入心、肺、胃经，《本经疏证》认为其“强阴，益精，保定肺气”；两者共奏滋肾润肺宁心之功。而五味子为木兰科植物五味子果实，味酸甘，性微温，入心、肺、肾经，取其养阴生津、敛肺滋肾之功，并可制约沙参、天冬、麦冬寒凉太过。四药并用，兼顾五脏，临床上用药比例一般为20∶20∶20∶3（北沙参、天冬、麦冬常用20 g，五味子3 g），治疗阴虚津亏证型pSS常获良效，因此被学术继承人作为经典药物组合收载入册[5]。现代药理研究也支持该药物组合部分成分可能对pSS患者有益：北沙参兼具抗炎、免疫调节作用，对抑制pSS肺间质纤维化进程有益[6]；麦冬多糖可保护大鼠颌下腺的炎症浸润性损害[7]；五味子药理涵盖抗肿瘤、调节免疫、保肝作用等多个方面[8]。然而单味中药成分已然驳杂，这4味药物的组合对pSS患者起效的作用靶点在哪里？剂量比例是否最佳？用传统动物模型验证成本过高，而近年来病灶与正常组织差异基因分析数据库、中药成分、靶点分析平台，及相应分析方法日益成熟，这使得我们从已知病理、药理研究数据发掘出专病专方的效应靶基因成为可能，因此对刘尚义教授养阴药物组合成分进行了调节pSS靶基因的生物信息分析。

病态组织和正常组织之间的差异性基因可能就是发病和治疗的关键，以GEO、GCBI为代表的数据库汇集了大量筛选病态与正常组织差异性基因芯片数据，以BATMAN、TCMSP为代表的数据库则汇集了已知中药主要的化学成分和这些成分调节的基因数据，而基于此类数据产生的生物信息分析技术则是筛选关键治疗靶点基因或通路的利器。如KEGG分析即是将筛选出的差异性基因与目前已知的信号通路构成基因库进行比对，明确在哪一条信号通路上这些差异性基因分布最广，则这条信号通路可能是与该疾病最密切的通路；而GO分析则是按不同分类标准（如组成成分、生物学功能等）将筛选出的差异性基因进行归类和统计，了解这些基因主要起什么作用、参与了怎样的生物学过程；PPI分析则是根据数据库已知研究结果罗列并统计一个基因与周围基因之间的关系（如激活、抑制、共表达等）并以网络图的方式显现出来，便于了解众多差异性基因中作用最突出的核心基因或关联最强的基因群体。目前，生物信息分析较多用于肿瘤靶向基因的筛选。杨晓慧等[9]报道，用生物信息方法挖掘出益气解毒方抗癌效应靶基因如AKT等，并在细胞和动物实验中得到了验证，证实该方法利于根据现有基因芯片数据推测靶基因筛选。我们通过链接GEO数据库的GCBI分析平台，从5块基因芯片中查找出同时表达在外周血、腮腺、唾液腺组织中pSS患者与正常人的差异性基因有67个（命名为数据集A），这些基因很可能是临床易于采集血样检查的致病基因，通过GO分析发现这些基因与感染病毒（如甲型流感、甲肝、乙肝等）导致的免疫反应相关程度高，且主要富集在细胞因子、干扰素、细胞凋亡相关通路上。这与目前临床上发现的pSS与病毒感染相关，病灶區正常外分泌腺浆细胞凋亡、淋巴细胞增多的观点基本一致。JAK-STAT信号通路、Toll样受体通路是常见的pSS研究通路，且取得了一些进展[10]。同时，我们将刘尚义教授4味养阴药物组合在BATMAN网上进行了成分靶点搜索和分析，发现五味子有效成分较多，其调节基因数量多于其他3味药，而取交集后4味药直接调节pSS潜在致病基因的数量并不多（如图2），其中五味子调节5个基因，涵盖了其他

3味药调节pSS的致病基因，这5个基因是FAS、CMPK2、BAFF、NMI、RSAD2。从此角度看，上调五味子剂量对pSS理论上可能有益；但这些基因是不是pSS的核心基因，刘尚义教授这一养阴药物组合调节的5个基因是否都对pSS治疗有益？尚待文献回溯分析的印证。

经过文献回溯，我们发现刘尚义教授养阴药物组合调节的5个基因与pSS发病确有一定关联：如BAFF属肿瘤坏死因子超家族成员，主要由单核细胞、树突状细胞及T细胞产生，可促进B细胞成熟和分化，在免疫应答中起重要作用，并与自身免疫密切相关。膜型BAFF主要表达于抗原提呈细胞，蛋白酶可使之水解而转变为可溶性BAFF，故在血液中可检测到。WANG-RENAULT等[11]用qPCR法进行pSS组与正常组B淋巴细胞亚群分析，发现BAFF mRNA的表达与B淋巴细胞HSA-miR-30b-5p的表达呈负相关，抑制HSA-miR-30b-5p后，BAFF表达量增高，提示两者之间存在负向调节关系，但具体机制尚不清晰。而新近研究发现，干扰素可上调唾液腺上皮细胞趋化因子5及BAFF的表达，直接或间接参与pSS病灶区的炎性破坏[12]。因此，抑制BAFF在唾液腺或腮腺组织的表达可能是控制pSS进展的一条途径，BAFF在外周血的表达量可能对监测pSS活动度有意义。Fas是肿瘤坏死因子受体家族的一员，已知它与其配体Fasl的相互作用，触发下游半胱天冬酶级联反应，激活NF-κB通路和MAPK通路，使表达Fas的细胞凋亡，导致各免疫系统疾病及肿瘤的发生。李玉玲等[13]

报道，pSS患者唇腺腺泡、唇腺导管上皮细胞中

γ干扰素、Fas、Fasl的阳性表达率均明显较对照组高，唇腺腺泡的上皮细胞中，以上三者两两之间呈正相关，提示Fas、Fasl可能是pSS患者唾液腺破坏的原因之一。CMPK2是一种蛋白质编码基因，参与了嘧啶核苷酸从头合成和代谢，影响了核苷二磷酸激酶活性和尿苷酸激酶活性，目前研究發现，其对应的非编码RNA（LincRNA-CMPK2）可刺激狼疮患者中性粒细胞产生干扰素，对干燥综合征也有诱发作用，但具体机制不清[14]。RSAD2是一个蛋白编码基因，与γ干扰素信号和免疫系统中的细胞因子信号传导相关，目前发现干扰素干预的树突样细胞可高表达RASD2，可能与pSS的发病有一定关联[15]。NMI也是一个蛋白编码基因，它辅助强化STAT应答白细胞介素-2（IL-2）、γ干扰素刺激产生的转录反应，尤其在IL-2相关通路中作用显著，而近年发现它参与了肿瘤细胞相关的DNA损伤反应、组织细胞死亡、上皮间质转化等生物过程[16]，但尚未见其参与pSS的病情进展研究。

综上所述，我们通过对pSS患者及正常人唾液腺、腮腺及血液样本差异性基因与刘尚义教授常用治疗阴虚津亏证型pSS的养阴药物组合干预基因数据集取交集、整理分析后发现：上述5个潜在靶基因大多参与了γ干扰素相关的自身免疫疾病及肿瘤的发病过程，其中BAFF和Fas与pSS造成的靶器官破坏尤其密切，而其他几个基因尚未见与pSS的相关研究报道；由蛋白相互作用网络分析图可见，以上5个基因与导致细胞凋亡的CASP8及MAP3K5联系较密切，经前面分析可见这些基因或对应蛋白由刘尚义教授养阴药物组合调节，且在pSS患者唾液腺、腮腺、血液中均有表达，这几个基因可能是该养阴药物组合对pSS起效的核心靶基因，是揭示其疗效机制的关键，且易于检测观察。因此，在接下来的研究中我们可以尝试观察该药物组合干预后对pSS患者或动物模型这5个指标的变化情况，探索该药治疗pSS的潜在机制。

然而，药物靶点预测性生物信息分析本质上属于对现有研究数据的整理分析，并不等于真实试验结果，结论仅为下一步试验指引方向；而目前无论是基因数据库还是药物成分数据库都不可能涵盖所有致病靶基因，尤其是该药物组合药味较多，每味药物均可能有未被报道的有效成分，因此，重要靶点或者有效成分在分析过程中可能遗漏。此外，单一基因、蛋白质表达水平变化可能会受到机体内其他因素的制约影响，不足以达到影响病情进展的结果。目前，公共基因数据库中的芯片数据资料多按西医学诊断标准（尤其是病理诊断分级标准为主）纳入组织标本为主，尚未发现根据中医辨证分型标准纳入的pSS患者腺体组织或血样标本，因此本研究只能按pSS临床主要特点和中医辨证理论以“阴虚津亏”这一临床最多见的证型进行“药物-靶基因”的分析讨论，难以评估痰热、血瘀等兼夹因素导致的基因差异。以上种种局限性促使我们必须继续进行体内外验证性试验研究。经上面数据挖掘分析得来的5个基因可作为细胞或动物实验研究的起点，这种“药物成分-致病基因”相关联的生物信息分析思路无疑是实验前值得进行的论证，必将对名老中医个人经验治法和特色方剂继承和探索有深远意义。

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收稿日期：2018-02-27；修回日期：2018-04-07