酶放大免疫分析法与二维液相色谱法监测癫痫患者血清中卡马西平浓度的比较

柳航 王敏 金路 张晋萍

[摘要] 目的 比較酶放大免疫分析法（EMIT）与二维液相色谱法（2D-HPLC）测定卡马西平血药浓度的差异。 方法 采集67例癫痫患者卡马西平血清样本，分别采用EMIT法和2D-HPLC法测定，其中二维液相的色谱条件如下：第一维色谱柱为ASTON-FAQ C8柱（4.0 mm×100.0 mm，3 μm，ANAX），流动相为乙腈-水（55∶45，v/v），流速为1 mL/min；中间柱为ASTON C18（4.6 mm×10.0 mm，3 μm，ANAX）；第二维色谱柱为Diamonsil-C18柱（4.6 mm×200.0 mm，5 μm，Dikma），流动相为乙腈-20 mmol/L乙酸铵（20∶80，v/v，pH=7.0），流速为1.2 mL/min。柱温为40℃，检测波长为285 nm。结果 两种方法差异无统计学意义，且相关性好，回归方程为y（2D-HPLC）=0.9876×x（EMIT）-0.0313，Bland-Altman分析显示两种方法一致性良好。 结论 EMIT法与2D-HPLC法测定的结果具有良好的一致性和相关性，应综合考虑实验室条件和人员配置等方面，采用合适的测定方法。

[关键词] 卡马西平；血药浓度；酶放大免疫分析法；二维液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（c）-0106-04

Comparison of EMIT and 2D-HPLC in the quantification of Carbamazepine in serum of patients with epilepsy

LIU Hang WANG Min JIN Lu ZHANG Jinping

Department of Pharmacy， the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School， Jiangsu Province， Nanjing 210008， China

[Abstract] Objective To compare the results of Carbamazepine in serum of patients with epilepsy determined by enzyme-multiplied immunoassay technique （EMIT） and two-dimensional liquid phase chromatography（2D-HPLC）. Methods The serum concentration of Carbamazepine in 67 epilepsy patients was determined by EMIT and 2D-HPLC， respectively. In 2D-HPLC method， two reversed phase liquid chromatography columns [ASTON-FAQ C8 （4.0 mm×100.0 mm， 3 μm， ANAX） and Diamonsil-C18 （4.6 mm×200.0 mm， 5 μm， Dikma） column] were used as the first and second separation dimensions， respectively. ASTON C18 （4.6 mm×10.0 mm， 3 μm， ANAX） column was used as a connector to transfer the eluent from the first dimensional column to the second column for further separation. The mobile phases of the two dimensions consisted of acetonitrile-H2O （55∶45， v/v） and acetonitrile-20 mmol/L ammonium acetate （20∶80， v/v， pH=7.0）， respectively. The first dimensional column flow rate was 1.0 mL/min， the second dimensional column flow rate was 1.2 mL/min. The detection wavelength was 285 nm， and the column temperature was 40℃. Results There were no significant differences in the serum concentrations of Carbamazepine detected by EMIT and 2D-HPLC. A good correlation was obtained between the two methods. The regression equation was y（2D-HPLC）= 0.9876 × x（EMIT）-0.0313. Bland-Altman plots analysis showed the two methods were consistent. Conclusion Both EMIT and 2D-HPLC methods have good consistency and correlation in the quantification of Carbamazepine. The laboratory conditions and staffing should be taken into consideration when a method is chosen for monitoring the concentration of Carbamazepine.

[Key words] Carbamazepine； Serum drug concentration； Enzyme-multiplied immunoassay technique； Two-dimensional liquid phase chromatography

癫痫（epilepsy）是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。卡马西平（Carbamazepine）属于氨基二苯乙烯衍生物，是治疗各种类型癫痫发作的首选药物，也是治疗三叉神经痛和舌咽神经痛发作以及躁狂抑郁症的一线药物[1-3]。由于其治疗窗窄（4～12 μg/mL），个体差异大，常见的不良反应包括视力模糊、头晕、乏力、恶心、呕吐等，在临床应用中，需要对患者的卡马西平血清药物浓度进行检测。依据检测的结果，调整和优化卡马西平给药剂量，提高疗效的同时避免和降低患者毒副作用[4-6]。目前国内各家医院，卡马西平血清药物浓度测定的主要方法包括紫外分光光度法[7]、高效液相色谱法[8]、免疫检测法[9]、液质联用法[10]等。综合考虑本科室的仪器条件和人员配置，作者分别采用酶放大免疫分析法（EMIT）和二维液相色谱法（2D-HPLC）检测卡马西平血清药物浓度，通过比较分析两种方法的检测结果，考察两种测定方法的准确度与相关性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

全自动临床化学分析仪VIVA-E（德国西门子公司）；2D-HPLC系统[全自动二维液相色谱耦合仪FLC2701（湖南德米特仪器有限公司）与LC-20A色谱部件（日本岛津公司）构成]；80-2低速离心机（常州中捷实验仪器制造有限公司）；centrifuge5424高速离心机（德国艾本德公司）；Vortex2涡旋仪（德国艾卡公司）；BS224型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试剂

卡马西平标准品购自中国食品药品检定研究院（批号：100142-201105，纯度：99.7%）；Emit2000卡马西平检测试剂盒（批号：4F018UL-J2，①抗体/底物试剂：抗卡马西平鼠单克隆抗体、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖-6-磷酸盐、防腐剂、叠氮化钠和稳定剂；②酶试剂：用细菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记的卡马西平、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、防腐剂、叠氮化钠和稳定剂，购自德国Dade Behring inc公司）；BIO-RAD血清复合质控品[批号：57351、57352、57353，伯乐生命医学产品（上海）有限公司]；乙腈（色谱纯，美国天地公司）；乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水由密理博纯水机制备。

1.3 样本

收集2017年4月15日～2017年10月31日南京鼓楼医院门诊和住院部服用卡马西平的患者血清样品，总共67份，同一份血清样品分成2份，两种方法分别检测。

2 方法与结果

2.1 EMIT法样品的处理与检测

取浓度为0、2、4、8、12、20 μg/mL的卡马西平定标溶液，采用卡马西平试剂盒检测，上机后仪器自动进样，依据定标点的检测结果拟合标准曲线，用于后续样品测定。

2.2 2D-HPLC法的样品处理与检测

2.2.1 色谱条件 第一维色谱柱为ASTON-FAQ C8柱（4.0 mm×100.0 mm，3 μm，ANAX），流动相为乙腈-水（55∶45，v/v），流速为1 mL/min；中间柱为ASTON C18（4.6 mm×10.0 mm，3 μm，ANAX）；第二维色谱柱为Diamonsil-C18柱（4.6 mm×200.0 mm，5 μm，Dikma），流动相为乙腈-20 mmol/L乙酸銨（20∶80，v/v，pH=7.0），流速为1.2 mL/min。柱温为40℃，检测波长为285 nm。

2.2.2 样品预处理 取血清样品300 μL于1.5 mL离心管中，加入600 μL乙腈，振荡混匀30 s，14 000 r/min离心5 min，离心半径为9.24 cm，取上清液400 μL，进样2D-HPLC系统检测分析。

2.2.3 方法专属性试验 在本研究所采用的色谱条件下，卡马西平的保留时间在6.79 min左右，峰形良好，拖尾因子在0.97～1.02之间，血清中的内源物质和其他杂质对样品测定没有影响，色谱图见图1。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取卡马西平标准品溶液，采用空白牛血清配制浓度分别为0.43、1.08、2.71、6.77、16.92、42.30 μg/mL的标准含药血清样品，构成标准曲线6个点，同时制备空白血清样品。按“2.2.2”项下预处理血清样品，采用2D-HPLC检测。以6个不同浓度C为横坐标，峰面积As为纵坐标，建立标准曲线，得到卡马西平线性回归方程：As=201609C+15806（r2 = 0.9994）。

2.3 EMIT法与2D-HPLC法准确度和精密度比较

EMIT法测定商品化的卡马西平血清质控，含低、中、高3种浓度（3.12、8.70、15.30 μg/mL）的样品各5份，连续测定3 d；平行制备含低、中、高3种浓度（1.36、21.15、33.84 μg/mL）的卡马西平含药血清各5份，按“2.2.2”项下方法进行样品处理，采用2D-HPLC进行测定，依据随行标准曲线方程，计算各血清样品中卡马西平的浓度，连续测定3 d。分别考察两种方法的日内、日间精密度及准确度，结果见表1。由此可见，EMIT和2D-HPLC两种方法的准确度和精密度均符合生物样品检定要求[11-12]。

2.4 检测结果分析

EMIT法的最低定量限为2 μg/mL，67个样品中有5个样品未能达到EMIT法的最低定量限，无法得出准确的检测结果，其余62个样品EMIT检测结果的平均值为（6.24±2.50）μg/mL；67个待测样品均达到2D-HPLC方法的最低定量限，检测结果的平均值为（5.77±2.78）μg/mL。剔除未达EMIT法最低定量限的5个样品，62个样品经两种方法测定血清中的卡马西平浓度比较分析（图2），经t检验，结果显示，两种方法检验结果差异无统计学意义（P = 0.81）。

采用Bland-Altman分析和Pearson相关分析，考察62个样品两种方法分别检测所得结果的相关性。基于Bland-Altman分析，绘制图3，可见两种方法测定结果比值的平均值为1.03，95%一致性界限分别为1.33和0.79，96.77%（60/62）的点在95%一致性界限内，说明两种方法一致性良好。以EMIT法测得的浓度为x，以2D-HPLC法测得浓度为y，得回归方程为y（2D-HPLC）=0.9876×x（EMIT）-0.0313，Pearson分析显示两者相关性良好（r = 0.9597，P < 0.01），见图4。

3 讨论

3.1 方法原理比较

EMIT检测的原理是样品中的卡马西平与试剂中用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）酶标的卡马西平竞争抗体结合位点，与抗体结合后，酶活性降低，试剂中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸被有活性的G6PDH转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，造成吸光度改变，应用分光光度计间接测定卡马西平的血药浓度[13]。

2D-HPLC是在常规HPLC的基础上，增加一维色谱柱，总共3个步骤完成血清中卡马西平的检测。首先，样品通过自动进样器进样，在一维色谱柱ASTON-FAQ C8（4.0 mm×100 mm，3 μm，ANAX）上初步分离，然后，样品中的卡马西平被中间柱ASTON C18（4.6 mm ×10 mm，3 μm，ANAX）截取保留，最后，转移至二维柱Diamonsil-C18（4.6 mm×200 mm，5 μm，Dikma）上，进行分离，由紫外检测器完成检测。色谱工作站通过时间程序控制3个步骤的切换，实现自动化控制，大大减少生物样品中内源性物质及其他共存成分的干扰[14-15]。

3.2 线性范围比较

EMIT最低定量限为2 μg/mL，线性范围为0～20 μg/mL。2D-HPLC最低定量限为0.43 μg/mL，线性范围为0.43～42.30 μg/mL。

3.3 检测过程和结果比较

从检测过程来看，EMIT采用商品化的试剂盒检测，具有样本检测时间短、用量少、前处理简单、多个品种能够同时检测等优点，适用于急诊和大批量样本的分析测定，其缺点在于仪器和试剂盒依赖进口，价格昂贵[16-18]；而2D-HPLC检测灵敏度高，试剂成本低，但不同品种样品需要更换色谱柱和流动相，预处理复杂，在方法的建立以及仪器的使用和维护方面对操作人员要求更高。

从检测结果来看，采用Bland-Altman分析和Pearson相关分析，两组测定结果无统计学差异，具有良好的一致性和相关性。

综上所述，EMIT和2D-HPLC均为有效且可靠的卡马西平血清浓度监测方法，应综合考虑实验室条件和人员配置等方面，选择合适的测定方法。

[参考文献]

[1] 蔡秀侠，宋昌鹏，牛艳花.卡马西平联合丙戊酸钠治疗早期癫痫的效果观察[J].中国实用神经疾病杂志，2015，18（7）：101-102.

[2] 杨琳，黄绍平.儿童难治性癫痫抗癫痫药物治疗策略[J].中国实用儿科杂志，2016，31（1）：5-10.

[3] 王龙海.卡马西平联合丙戊酸钠治疗额叶癫痫的疗效观察[J].临床合理用药杂志，2016，9（13）：64-65.

[4] 潘骊，李素华，张晓乐.146例卡马西平药品不良反应文献分析[J].中国药物警戒，2017，14（4）：230-234.

[5] 石建，张彦，陈之遥，等.卡马西平所致不良反应49例临床特点及防治对策[J].中国老年学，2016，36（19）：4880-4881.

[6] 吴冬燕，朱国行.抗癫痫药物的分类、作用机制与不良反应[J].上海医药，2015，36（9）：3-7.

[7] 王萌，杨丽荣，王宏鑫，等.紫外分光光度法在卡马西平中毒诊断中的临床意义[J].武警后勤学院学报：医学版，2017，26（9）：770-772.

[8] 梁金凤，李伟镇，陈清霞，等.高效液相色谱法测定人血浆中卡马西平浓度[J].海峡药学，2015，27（12）：252-255.

[9] 朱旭，张媞，田敏，等.高效液相色谱法和荧光偏振免疫法测定卡马西平血药浓度的比较分析[J].中国临床药理学杂志，2016，32（1）：68-71.

[10] 杜晓琳，雍小兰，黄娟，等.HPLC-MS/MS法检测人血浆中卡马西平浓度[J].解放军药学学报，2015，31（6）：500-502.

[11] 吴先闯，宋晓勇，张永州.HPLC法与EMIT法检测血样中甲氨蝶呤浓度的比较研究[J].中国药师，2012，15（11）：1598-1600.

[12] 朱婷婷，储小曼，赵宇蕾，等.CMIA、FPIA、MEIA与EMIT测定血药浓度的比较分析[J].药学与临床研究，2015， 23（5）：437-442.

[13] 乔小云，朱怀军，王羽.酶放大免疫分析法监测万古霉素血药浓度的质控评估[J].药学与临床研究，2013，21（5）：516-519.

[14] 王峰，朱运贵，罗雪梅，等.新型二维液相色谱测定百草枯尿液浓度的研究[J].中国药学杂志，2017，52（10）：871-879.

[15] 肖俊辉，李林，王峰，等.二维高效液相色谱结合拦截技术测定舒巴坦血药浓度[J].中南药学，2017，15（5）：591-594.

[16] 王菁，刘璐，郑恒，等.治疗药物监测的研究进展[J].中国医院药学杂志，2017，37（1）：1-8.

[17] 庄奕筠，张吟，高雅莉，等.超高效液相色谱同时测定人血清中4种抗癫痫药物的浓度[J].中国現代医生，2016， 54（12）：105-107，111.

[18] 谢吉科，姜德春.治疗药物监测的研究进展[J].中国医药，2011，6（2）：379-382.

（收稿日期：2018-03-02 本文编辑：张瑜杰）