妇科门诊患者阴道毛滴虫及其病毒感染情况分析*

罗 倩，李兴玉，廖永丽，罗跃梅，陈旭辉，周必英

1.遵义医学院 第一临床学院(遵义563000)；2.遵义医学院 寄生虫学教研室(遵义563000)

阴道毛滴虫(trichomonasvaginalis,TV)是一种寄生于人体泌尿生殖道的鞭毛虫，主要寄生于女性的阴道、尿道，男性的尿道、前列腺，引起滴虫性阴道炎、尿道炎、前列腺炎等，严重者可致不育不孕[1-2]。随着HIV等性传播疾病的增加，TV感染率亦呈上升趋势[3]。研究[4-9]报道，我国TV感染率约为6.20%～8.96%。目前，阴道毛滴虫病已被列为性传播疾病之一。阴道毛滴虫病毒(trichomonasvaginalisvirus,TVV)是一种专性寄生于TV内的双链RNA病毒。研究[10-11]表明，TVV可影响TV虫体蛋白的表达，从而降低虫株的致病力和毒力，同时对甲硝唑治疗产生的耐药性有一定的拮抗作用。为了解遵义医学院附属医院妇科门诊患者TV及TVV感染情况，本研究对3 321例就诊于妇科门诊并被送检阴道分泌物进行TV筛查，并对3 321例女性患者进行了调查，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2016年3月至2017年3月于遵义医学院附属医院妇科门诊就诊,并被送检的3 321例阴道分泌物进行TV筛查，并对相应的3 321例患者进行问卷调查。纳入标准：1)患者有阴道炎症状，如白带异常、阴道瘙痒等；2)标本存放时间≤20 h；3)患者同意配合调查。排除标准：1)患者既往明确诊断TV感染并已经过药物治疗；2)标本存放时间>20 h；3)标本污染或无法涂片镜检；4)患者拒绝调查。本次调查共发放问卷3 321份，回收有效问卷3 321份，有效率100%。

1.2 主要试剂与仪器

蛋白胨、麦芽糖、L-盐酸半胱氨酸、青/链霉素混合液(双抗)、瑞氏-姬姆萨复合染液购自北京索莱宝公司；灭活胎牛血清购自北京百奥思科生物科技有限公司；细胞基因组DNA小量提取试剂盒、第一链反转录试剂盒、2×Utaq PCR Master Mix购自北京庄盟生物科技有限公司；琼脂糖为西班牙进口产品；磷钨酸染液由遵义医学院电镜室配制；其他试剂均为国产分析纯。电热恒温培养箱购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；核酸/蛋白电泳装置购自北京六一仪器厂；PCR仪购自美国MJ-Research公司。

1.3 方法

1.3.1 TV感染情况调查 妇科门诊医生用无菌棉拭子采集3 321例门诊患者阴道后穹窿阴道分泌物，将其直接涂布在加有生理盐水的载玻片或涂片进行染色，镜检查TV滋养体。并根据年龄、职业、卫生习惯等感染因素对患者进行问卷调查。

1.3.2 TVV感染情况调查 为了解TVV感染情况，需进一步建立TVV纯培养体系。按文献[12]方法制作肝浸汤培养基，略作如下改进：使用1% NaOH溶液调pH至5.83，4 mL/每管进行分装，使用前将培养基置于37 ℃ 30 min，再加入 1 mL灭活血清和50 L双抗。将上述所得TV阳性株接种于新鲜培养基中37 ℃培养。每日取1滴于显微镜下观察虫体数量及生长状况，约每72 h传代1次，连续培养3代。

取1滴培养液于载玻片上，光镜下观察滋养体的活动情况。然后将培养48 h的培养液吸取2 mL于离心管中，1 500 r/min离心10 min，弃掉上清，吸取沉淀于载玻片上均匀涂开，自然干燥后甲醇固定10～15 min。滴加瑞-姬染液将涂片完全覆盖，染色1 min后滴加等量PBS(pH 7.35～7.45)，混匀后染1～2 min，冲洗,干燥，光镜观察。

根据已发表的TVV基因序列(U08999),设计上游引物为5'-ACCGTTTCCACGACCCAG-3'；下游引物为5'-TGTGAAGTCCAGCCAAGC-3'，引物由南京钟鼎生物公司合成。参照细胞基因组DNA小量提取试剂盒以及第一链反转录试剂盒说明方法提取TV总核酸并得到TVVcDNA：取提取到的TV总核酸5 L,加入RT Enzyne Mix 3 L,RT Reaction 7 L，再用ddH2O调整总体积至20 L，45 ℃孵育50 min，70 ℃ 15 min后置冰上冷却，即得cDNA。然后以cDNA为模板进行PCR反应，反应体系为：cDNA 3 L,2×Utaq PCR Master Mix 25 L，上下游引物各5 L(2 pmol/ L)，ddH2O 12 L；反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环扩增30次，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。对初步筛选到的携病毒株，2 000 r/min离心10 min，收集虫体，送至遵义医学院电镜室，用1%磷钨酸负染色，透射电镜观察。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析和处理数据，定性资料采用例数(%)描述，组间比较采用2检验或Fisher确切概率法。检验水准ɑ 除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 TV感染率及不同年龄患者TV感染情况

3 321例研究对象中，感染TV 76例，检出率为2.29%。患者主要症状为外阴瘙痒、灼热，白带增多、呈泡沫状或脓性，外阴疼痛、性交痛等。不同年龄组患者阴道毛滴虫感染情况中，30～39岁组检出率最高，为4.16%(39/937)，组间比较，差异有统计学意义(2=26.568，P<0.001)(表1)。

表1 不同年龄组人群的TV感染分布情况

2.2 不同职业患者TV感染情况

将患者分为农民、工人、机关事业、其他4类职业，其中农民检出率最高，为3.60%(34/945)；其次为工人，检出率为2.57%(25/973)；机关事业单位和其他检出率均为1.21，组间比较，差异有统计学意义(2=14.612，P<0.05)(表2)。

表2 不同职业人群TV感染分布

2.3 不同卫生习惯及性传播知识了解程度人群TV感染情况

从不用专用盆和毛巾清洗外阴的人群以及内外衣裤从不分开洗的人群检出率相对较高，分别为3.45%(38/1 103)和3.22%(39/1 210)，组间比较，差异有统计学意义(2分别为14.280,11.624，P<0.05)。经常了解性传播疾病知识的人群检出率相对较少，为1.34%(14/1 046)，组间比较，差异有统计学意义(2=9.631，P<0.05)(表3)。

表3 不同卫生习惯及性传播知识了解程度人群TV感染分布

2.4 TV的培养与形态观察

光镜下可见虫体呈无色透明，有折光性(图1)。虫体活动力强，可呈圆形或椭圆形，借助鞭毛摆动旋转前进，偶见虫体聚集成团。瑞-姬复合染色后虫体显紫蓝色，核呈深蓝色，虫体呈圆形或椭圆形，鞭毛显紫红色，4根前鞭毛以及轴柱伸出体外，内部结构尚不清楚(图2)。光镜下观察到虫体，说明培养成功。共取得虫株76株，培养成功58株。

2.5 TV携病毒株的筛选

对从TV滋养体提取的总核酸进行电泳以及RT-PCR扩增，电泳图谱均未出现TVV目的基因条带，结合电镜亦未找到病毒颗粒。

图1 TV滋养体(未染色)20×

图2 TV滋养体(瑞-姬染色)100×注：A：深蓝色核；B：伸出体外的4条前鞭毛和1条轴柱；C、D：椭圆形或圆形TV滋养体

3 讨论

TV是一种引起人体泌尿生殖道感染的病原体，主要通过直接或间接接触传播。女性TV感染主要表现为外阴瘙痒、灼热感、泡沫状白带，男性主要表现为尿道炎或无症状带虫状态[13-14]。TV还可使小鼠成为带虫者，某些灵长类动物如猴感染TV后也可出现临床症状[15-16]。TV感染呈世界性分布，在我国亦有较高的感染率，其中已婚女性较未婚女性显著增高，中年女性感染相对较多，不同职业亦对感染率有一定影响，个人卫生较差也会导致感染率增高。本次调查发现，2016年3月至2017年3月遵义医学院附属医院妇科门诊患者TV检出率约为2.29%，TV感染多集中在中年期女性，即30～49岁检出率相对较高，可能与此年龄段人体性机能比较旺盛有关。从职业分布来看，农民的检出率最高，其次为工人，可能与人群综合素质较低且职业环境较差有关，大部分农民和工人文化水平较低下，卫生保健意识相对薄弱，经常忽略自己的身体情况，从而导致感染率增加。不良卫生习惯以及月经期间阴道pH升高亦会导致TV繁殖增多，因此，养成良好的卫生习惯，保持内衣内裤等贴身衣物的清洁以及注意经期卫生有利于降低TV的感染率。此外，普及医疗保健知识，加强性传播知识的宣传教育，增强卫生保健意识，定期进行健康体检，亦有利于降低TV感染率。

本研究采用肝浸汤培养基建立TVV纯培养体系，关于培养基合适的pH值，国内学者认为在5.2～6.6[17-19]，本研究经过反复多次摸索后发现，pH在5.83左右的环境下，虫体数量多，生长快速且活跃，生存时间也较长，少数可达5～6 d。同时采用瑞-姬复合染液对TV滋养体进行形态学鉴定，染色后虫体轮廓清晰，但内部结构尚不清楚，需进一步探索更好的染色方法。

1986年，Wang等[20]在纯化的TV核酸中发现约5.5 kb的核酸电泳带后，进一步采用分子生物学方法确定TV中存在dsRNA病毒，并命名为TVV。电镜下TVV直径大小为33～200 nm，可呈球形、丝状或圆柱状，主要分布在胞质中高电子密度核心、低电子密度中央部分和外周，细胞核内较少见[21]。赵月平等[22-24]在我国TV长春株中分离到TVV，电镜下形态与国外结果一致，并对部分基因进行克隆分析，这是国内首次成功克隆出TVV RDRP基因序列。王丽娟等[25-26]研究发现TVV的寄生会对TV的基因多态性产生影响，且无病毒寄生的虫体易发生耐药。TVV在不同地区感染率不同，菲律宾为19%[27]，韩国为14%[28]，德黑兰为50%[29]，我国河南地区为20%[26]。本研究并未找到TV携病毒株，分析可能与以下因素有关：1)TV的体外培养体系可能对TVV生长有一定影响。有TVV寄生的TV经过长期体外培养后会导致TVV减少，其原因需进一步研究；2)仍未成功建立TVV体外纯培养体系,需进一步摸索TVV的纯培养条件；3)此次调查样本量较少，TV仅培养成功58株，需进一步扩大样本量提高TVV的检测率；4)电镜标本处理时，未进行离心纯化，为此次研究的疏漏，需进一步完善；5)或是由于不同地区虫株差异或病毒差异所致等。具体原因还需进一步探索。

综上所述，TV可严重危害女性身体健康，TV感染与自身洁阴习惯、环境卫生条件、经济水平、防病知识了解水平等息息相关。只有通过养成良好卫生习惯、加强性传播知识的普及才能减少TV传播，降低患病风险。关于TVV的培养条件及筛选仍有待进一步提高。