育龄妇女不同同型半胱氨酸水平与叶酸代谢关键酶基因多态性分布研究

陈博 孙晓岩 袁细妹

出生缺陷是指子宫内胎儿因多种原因而发生解剖学上和功能上的异常, 临床上主要表现为兔唇、四肢异常、聋哑、白血病等。该类疾病发病率高, 可占活产儿的3%［1］。出生缺陷发病多与生殖道感染、内分泌异常、外部用药等密切相关, 目前研究发现, 出生缺陷患儿常伴有母体叶酸代谢功能紊乱、Hcy血浆内水平偏高, 其中叶酸代谢关键酶基因多态性在出生缺陷方向的研究逐渐得到关注［2］, 但其与Hcy两者的关系研究却比较少。本研究选取2016年1月~2017年12月来本院进行孕前或孕期体检的高Hcy水平的育龄妇女和Hcy水平正常的健康育龄妇女作为研究对象, 分析叶酸代谢关键酶基因多态性分布与Hcy水平的关联。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2016年1月~2017年12月来本院进行孕前或孕期体检173例高Hcy水平(>15 μmol/L)育龄妇女作为实验组, 另选同期210例进行孕前或孕期体检的Hcy水平正常的健康育龄妇女作为对照组。所有研究对象均完成遗传检测、Hcy检测, 熟悉了解本研究内容并积极配合研究；排除合并心脏、肝脏、肾脏等重大器官疾病的患者；排除合并有恶性肿瘤、血液系统以及免疫系统疾病的患者；排除含有糖尿病、消化系统疾病患者。

1. 2 方法

1. 2. 1 同型半胱氨酸检测 分别于晨起收集两组育龄妇女空腹肘静脉血5 ml, 上下颠倒5~8次充分混匀, 于2 h内以3000 r/min离心20 min, 分得血浆。使用日立7600全自动生化仪进行检测, 按照试剂盒说明书操作步骤完成Hcy检测,其中Hcy在5~15 μmol/L浓度范围内视为正常。

1. 2. 2 基因型检测 对所有受检者空腹抽取外周静脉血5 ml, DNA通过柱式抽提试剂盒进行抽提, 提取结束后并进行DNA浓度测定。MTRR A66G、MTHFR A1298C及C677T的基因多态性采用Mass ARRAY技术进行SNP分型检测, 利用MASS ARRAY的引物设计平台设计PCR引物, 包括一对多重PCR扩增引物, 及一条MASS EXTEND延时引物。然后进行聚合酶链反应, 每个反应体系总体积为5 μl, 1 μl包含浓度为 20 ng/μl的 DNA模板 , 1.8 μl无酶水 , 0.5 μl 10X PCR buffer, 0.4 μl 25 μM MgC12, 0.1 μl 25 μM dNTP Mix, 1 μl 0.5 μM Primer Mix, 0.2 μl 5 U/μl PCR Enzyme。 设 定 反 应 条 件 为 ：95℃ 2 min, 然后再完成20个循环的扩增(95℃ 30 s, 56℃ 30 s,72℃ 1 min)与45个循环的扩增。结束整个反应过程之后得到的PCR产物经过树脂纯化后在Nanodispenser Spectro CHIP芯片上点样, 然后进行Mass ARRAY 分析, 每个检测点只需3~5 s, 进行全自动分析, 通过TYPPER4.0软件分析实验结果。

1. 3 观察指标 比较两组育龄妇女叶酸代谢关键酶(MTHFR酶和MTRR酶)基因型频率分布的差异。分析两组育龄妇女H-W 遗传平衡结果。

1. 4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验；按照Hardy-Weinberg(H-W)平衡法检测样本的群体代表性。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 两组育龄妇女H-W 遗传平衡结果 将H-W遗传平衡检验应用于两组患者基因分析, 结果可得, 各位点基因频率实际值与预计值分布情况差异无统计学意义(P＞0.05), 即取样样本具有群体代表性。

2. 2 两组育龄妇女叶酸代谢关键酶基因型频率分布情况实验组MTHFR C677T的TT基因型、MTHFRA1298C的AA基因型分布频率分别为68.2%、87.3%明显高于对照组的13.8%、65.2%, MTRR A66G 的AA基因型分布频率为48.0%明显低于对照组的60.0%, 差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组育龄妇女叶酸代谢关键酶基因型频率分布情况［n(%)］

3 讨论

叶酸作为一碳单位重要载体, 在甘氨酸、丝氨酸以及Hcy体内代谢过程中, 发挥重要作用, 同时也参与到DNA以及血红蛋白的合成过程当中［3］。叶酸代谢过程关键酶MTHFR和MTRR参与到Hcy向蛋氨酸(Met)转化以及DNA合成的过程, 其代谢改变可严重扰乱机体叶酸代谢网络［4-7］。目前, 叶酸代谢关键酶主要集中于基因多态性研究, 但其与高Hcy水平两者的关系的研究却较少。本研究则采用对比分析的研究方式分析育龄妇女Hcy水平与叶酸代谢酶基因分布关系, 为不良妊娠的分析提供参考。

体内Hcy水平偏高严重影响血管增殖以及相应的修复功能, 进而引发孕期妇女体内胎儿发生血管病变以及凝血系统障碍等, 而叶酸代谢相关酶在体内Hcy水平的维持中十分重要。MTHFR酶可催化同型半胱氨酸进行甲基化生成Met, 保持Hcy处于体内平衡, 其中MTHFR酶的C677T 和A1298C基因位点在不良妊娠的研究中得到广泛关注［8-11］。MTRR是Met合成酶的辅助因子, 同样维持体内Hcy水平, 其中MTRR的A56C和A66G两个基因位点改变可引发Hcy含量升高［12-14］。马国海等［15］通过对766例育龄妇女研究发现,不同Hcy水平患者MTHR和MTRR基因频率分布存在明显不同, 本研究发现, 实验组MTHFR C677T的TT基因型、MTHFRA1298C的AA基因型分布频率分别为68.2%、87.3%明显高于对照组的13.8%、65.2%, MTRR A66G 的AA基因型分布频率为48.0%明显低于对照组的60.0%, 差异有统计学意义(P<0.05)。与上述结果基本一致。MTHFR C677T可使得体内的丙氨酸(A)-缬氨酸(T)转换增加, AT或TT基因型发生改变, 代谢酶水平发生改变, Hcy含量水平升高, 其中纯合子TT基因型改变可使酶的活性降低达70%左右。

MTRR 催化甲基钴胺再生, 是蛋氨酸合成酶的辅助因子,蛋氨酸合成酶对于维持蛋氨酸和四氢叶酸在细胞内水平及维持Hcy 在无毒性的水平具有重要作用。MTRR 的A66G变异会导致MTRR表达降低, 引起Hcy 的血浆水平升高。本研究显示, 观察组和对照组MTRR 的这两个位点基因分布频率差异具有统计学意义(P＜0.05)。

综上所述, 叶酸代谢关键酶基因, 即MTHFR C677T位点、MTHFRA1298C位点和MTRR A66G 位点的突变是引起育龄妇女血浆HCY升高的重要原因之一, 可能与不良妊娠相关。可见, 对育龄妇女进行孕前叶酸代谢通路关键酶基因变异检测, 并结合血浆同型半胱氨酸水平检测, 有助于个体进行个体化叶酸补充方案, 提高补充叶酸的依从性, 预防出生缺陷的发生。