GREB1基因多态性与老年骨质疏松性骨折的相关性研究

郑繁荣 吕鹏飞 唐冲 侯晓飞 张昆 刘正 张清华 栗剑 张光武

北京大学首钢医院骨科，北京 100144

骨质疏松症(osteoporosis，OP)的特征表现为骨量降低，骨微结构破坏，骨强度下降及骨折风险增加[1]。骨质疏松症包括原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。原发性OP分为绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)、老年骨质疏松症(senile osteoporosis，SOP)和特发性骨质疏松症(idiopathic osteoporosis，IOP)。其中SOP为70岁以后发生的骨质疏松症，又称为Ⅱ型骨质疏松症。人口老龄化已出现在全球许多国家，我国亦不例外。相关资料显示，2014年，中国60岁上的老年人口已突破2亿，预计到2050年左右老年人口将达到全国人口总数的1/3。而相关资料统计显示，SOP及其引发的骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture，OF)数量高于心脑血管病及乳腺癌的总和。SOP除了危害老年人的身体健康之外，还严重影响其心理，造成严重的经济负担和社会负担，故全社会应高度重视SOP及其引发的问题。

研究SOP的相关机制对预防SOP及OF的发生具有重要意义。SOP及OF的发生由遗传因素和环境因素共同作用所致，其中遗传因素决定了60%～80%的峰值骨量。自Morrison等[2]于1994年首次提出应用维生素D受体等位基因预测骨密度(bone mineral density，BMD)之后，各国学者相继发现许多其他候选基因。Hegarty等[3]于近期发现乳腺癌雌激素调控基因1(growth regulation by estrogen in breast cancer 1，GREB1)的基因多态性与高加索人群骨密度相关，而目前国内尚未有针对该基因与骨量或骨折风险的相关性研究。故本文就GREB1基因rs10929757、rs5020877位点多态性与SOP的相关性进行研究，对该基因与OF风险的相关性进行探讨。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1一般资料：研究对象来自 2016 年1月至2017 年7月北京大学首钢医院骨科病房、老年干部病房的226例患者。骨折组(骨质疏松性骨折)100例，均为椎体骨折患者，其中男性37例，女性63例；年龄70～94岁，平均(76.190±5.208)岁。对照组(无骨质疏松同时无骨折)126例，其中男性46例，女性80例；年龄70～90岁，平均(75.318±4.300)岁。本研究通过医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.1.2纳入标准：根据原发性骨质疏松症诊疗指南，腰椎或髋部1处及以上部位T≤-2.5SD则定义为骨质疏松。T≤-2.5SD且发生骨折的患者为骨折组。腰椎或髋部所有部位T均>-2.5SD的患者为对照组，两组患者年龄≥70岁；理解本研究的目的及要求并签署知情同意书。

1.1.3排除标准：伴随严重合并症；合并影响骨代谢疾病，包括甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、垂体疾病等；近1年应用双膦酸盐类药物；近6个月使用影响骨代谢药物，包括骨化三醇、雌激素、活性维生素D、降钙素、类固醇激素等。

1.2 研究方法

1.2.1骨密度测定：受试者取仰卧位，应用双能X线骨密度仪(QDR-4500；Hologic，Inc.，Waltham，MA，USA)测量髋部和腰椎骨密度值。

1.2.2SNP分型：所有患者清晨空腹时采集静脉血2 mL，置于EDTA 抗凝管中，存于-80 ℃冰箱等待提取DNA。外周血白细胞DNA提取采用酚/氯仿法，提取后存于-20 ℃冰箱。IGF-1基因rs2229765、rs35767位点引物由上海生物工程技术有限公司合成。rs10929757位点上游引物：5′-GCATCTAGGTGGTAGCCGAG-3′，下游引物：5′-GCTCACACCTCAGGGAAAGC-3′；rs5020877位点上游引物：5′-TCTCTCTTTCAGGAGCACTTTC-3′，下游引物：5′-AGAAAGATTCAGCCTTTCCTCT-3′。应用Snapshot技术进行基因分型。核心反应体系包扩测序酶、荧光标记的 ddNTP、紧挨多态位点5′-端不同长度的延伸引物、包含SNP位点的PCR产物模板。通过反应，引物延伸一个碱基即终止，再经测序仪检测，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 两组患者的基本情况

两组研究对象在性别、年龄和体质量指数上差异无统计学意义(P>0.05)。两组各部位BMD值比较，骨折组均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1。

表1 两组患者一般情况比较

2.2 两组患者在rs10929757位点等位基因频率和基因型频率比较

两组患者等位基因和基因型均符合遗传学Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折组C、A等位基因频率分别为49.0%、51.0%，对照组C、A等位基因频率分别为51.6%、48.4%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。骨折组CC、CA、AA基因型频率分别为23.0%、52.0%、25.0%，对照组CC、CA、AA基因型频率分别为23.8%、55.6%、20.6%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 两组男性患者在rs10929757位点等位基因频率和基因型频率比较

两组男性患者等位基因和基因型均符合遗传学Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折组C、A等位基因频率分别为36.5%、63.5%，对照组C、A等位基因频率分别为52.2%、47.8%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。骨折组CC、CA、AA基因型频率分别为13.5%、45.9%、40.5%，对照组CC、CA、AA基因型频率分别为28.3%、47.8%、23.9%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 两组女性患者在rs10929757位点等位基因频率和基因型频率比较

两组女性患者等位基因和基因型均符合遗传学Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折组C、A等位基因频率分别为56.3%、43.7%，对照组C、A等位基因频率分别为51.2%、48.8%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。骨折组CC、CA、AA基因型频率分别为28.6%、55.6%、15.9%，对照组CC、CA、AA基因型频率分别为21.3%、60.0%、18.8%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 两组患者在rs5020877位点等位基因频率和基因型频率比较

两组患者等位基因和基因型均符合遗传学Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折组G、A等位基因频率分别为6.9%、93.1%，对照组G、A等位基因频率分别为6.3%、93.7%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。由于GG基因型仅有1例，且GA型少于AA型，故将GG型与GA型合并计算。骨折组GG+GA、AA基因型频率分别为12.0%、88.0%，对照组GG+GA、AA基因型频率分别为11.9%、88.1%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6 两组男性患者在rs5020877位点等位基因频率和基因型频率比较

两组男性患者等位基因和基因型均符合遗传学Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折组G、A等位基因频率分别为10.1%、89.9%，对照组G、A等位基因频率分别为7.0%、93.0%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。骨折组GG+GA、AA基因型频率分别为16.2%、83.8%，对照组GG+GA、AA基因型频率分别为13.0%、87.0%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.7 两组女性患者在rs5020877位点等位基因频率和基因型频率比较

两组女性患者等位基因和基因型均符合遗传学Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折组G、A等位基因频率分别为5.0%、95.0%，对照组G、A等位基因频率分别为6.0%、94.0%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。骨折组GG+GA、AA基因型频率分别为9.5%、90.5%，对照组GG+GA、AA基因型频率分别为11.3%、88.7%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.8 rs10929757位点不同基因型患者骨密度比较

在rs10929757位点，总体、男性和女性患者中不同基因型患者骨密度值比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.9 rs5020877位点不同基因型患者骨密度比较

在rs5020877位点，总体、男性和女性患者中不同基因型患者骨密度值比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2 rs10929757位点不同基因型患者骨密度比较(g/cm2)

表3 rs5020877位点不同基因型患者骨密度比较(g/cm2)

3 讨论

据估计，2010年中国在OF的花费接近100亿美元，预计2035年增加1倍，而2050年将达到254亿美元[4]。并且OF患者术后仍有较高的再骨折风险[5]。因此，应积极研究OP和OF的发生机制，并对其危险因素进行干预，以降低OF造成的相关医疗费用。种族、高龄、绝经后女性、OF家族史为OP的不可控危险因素，不健康的生活方式、体质量指数过低等为可控危险因素。为尽可能减少混杂因素干扰，本研究纳入患者年龄均大于70岁，并人为控制性别比例及体质量指数，使两组研究对象具有可比性。临床上将BMD检查作为诊断OP的金标准，已有大量研究证实了相关基因与BMD的相关性[6-7]。故本研究以BMD检查结果分组，将全身1处及以上部位出现T≤-2.5SD且发生骨折的患者定为骨折组，将全身无1处部位出现T≤-2.5SD且无骨折的患者定为对照组。

国内外许多研究显示，女性在绝经后发生OP及OF的风险随绝经年限增加而呈现出明显增高的趋势[8-9]。雌激素水平是女性BMD的主要影响因素。正常女性BMD在30岁左右达到峰值，在围绝经期平缓下降；而在绝经后，由于雌激素水平明显降低，使得成骨细胞活性绝对下降，破骨细胞活性相对增强，于是血钙水平明显增加。在负反馈作用下，甲状旁腺激素的分泌受到抑制。由于维生素 D 的内分泌系统主要受甲状旁腺激素调节，故维生素 D的合成随之受到影响[10-11]。而维生素D作为影响钙离子吸收的因素之一[12]，其降低将造成钙离子在消化道内吸收减少，进一步造成骨形成减少，骨吸收增加，导致BMD迅速下降。随着绝经年限的增加，机体各脏器功能亦逐渐减弱，细胞衰老造成雌激素分泌逐年减少，进一步减少维生素D和钙离子的吸收，骨吸收和骨形成失衡愈发显著，发生OF的概率随即增加[13]。因此，鉴于绝经后女性为OP的独立危险因素，本研究亦根据性别进行了亚组分析。

GREB1基因是一种激素反应性基因，亦为雄激素、雌激素信号通路中常见的靶基因[14]。该基因定位于2p25.1，由雌激素诱导产生作用，并直接由雌激素受体调控其表达[15]。在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中，GREB1的表达与月经周期内的雌激素水平密切相关[16]。GREB1基因的cDNA有至少3个不同的非编码5’端外显子，而这些外显子的转录依赖雌激素的调控，提示存在多个雌激素诱导型启动子。GREB1亦可调控雄激素，雄激素受体反应元件又可促进GREB1的表达，而抑制GREB1可阻断雄激素所诱导的组织生长[17]。雌激素和雄激素都可调节骨重建使骨结构保持完整。

Hegarty等[3]对477个无血缘关系的绝经后女性的研究发现，在rs10929757位点，A等位基因频率为38%，A等位基因携带者具有更高的股骨颈部BMD值。本研究中，在rs10929757位点，在总研究对象中和男性人群中，发现骨折组A等位基因频率均大于对照组。此外，在两组男性患者的比较中，骨折组为63.5%，对照组为47.8%，差异具有统计学意义(P<0.05)。两组患者在总体和各亚组中各基因型比较差异均无统计学意义(P>0.05)。在总体、男性和女性患者中分别比较该位点不同基因型患者BMD值，发现男性A等位基因携带者具有更低的全髋部和腰椎部BMD值，而女性A等位基因携带者具有更高的全髋部BMD值，女性AA型具有更高的腰椎BMD值，但以上结果均无明显差异，这可能与样本量少有关。本研究说明老年男性在rs10929757位点A等位基因携带者椎体OF风险更高，该基因位点多态性存在性别差异和种族差异。

Hegarty等[3]同时对来自229个家庭的508个成员的研究发现，在rs5020877位点，G等位基因频率为9%，G等位基因携带者具有更高的腰椎和股骨颈部BMD值。本研究中除男性骨折组的G等位基因频率(10.1%)以外，其余均低于Hegarty研究的结果。两组患者在总体和亚组中GG、GA基因型和AA型的比较差异均无统计学意义(P>0.05)。在总体、男性和女性患者中分别比较该位点不同基因型患者BMD值，发现G等位基因携带者无论男女均具有较高的髋部BMD值，女性G等位基因携带者具有更高的腰椎BMD值，但差异均无统计学意义(P>0.05)，增加样本量可能出现显著区别。因此，本研究未发现rs5020877位点基因多态性与老年OF相关。

综上所述，本研究提示老年男性在rs10929757位点A等位基因携带者椎体OF风险更高，未发现rs5020877位点多态性与老年OF的相关性。然而，本研究具有以下局限性：首先，样本量较小，代表性不足，未能进行家系研究进一步证实相关性，这可能是造成某些阴性结果的原因；其次，未能综合比较不同骨折类型、合并症、生活方式、环境以及雌激素水平等因素；此外，GREB1基因影响骨量的分子机制仍需进一步阐明。因此，下一步需扩大样本量，并进行更广泛和深入的研究，进一步探讨OP的发生机制，为预防OF提供理论基础。