芳香族化合物前体物质酪氨酸和苯丙氨酸在白酒中的来源解析

聂元皓，徐岩，吴群*，杜海*

1( 江南大学 酿酒科学与酶技术中心，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 2(宿迁市江南大学产业技术研究院，江苏 宿迁，223814)

芳香族化合物是指分子中含有至少一个苯环的有机化合物[1]，含量仅占白酒中风味组分总量的0.09%～0.18%[2]，但却具有阈值低、香味强度大、香味保留时间长的特点[3]，对成品白酒的质量具有很大影响[4-5]。如苯乙酸乙酯的阈值为650 μg/L，具有令人愉悦的蜂蜜香[6]；苯乙醛的阈值为4 μg/L，具有玫瑰花香[7]，这些成分对白酒口感的提升具有重要的作用。而间甲酚具有皮革味[8]，对甲酚具有动物臭味[7]，对酒体风味造成负面影响。

白酒中的芳香族化合物的来源之一就是原料中芳香族氨基酸的降解[9]，涉及的途径包括以下几条：(1)在芳香族氨基酸转氨酶的作用下，酪氨酸(tyrosine, Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)分别降解为对羟基苯丙酮酸和苯丙酮酸，随后经过氧化脱羧反应生成对羟基苯乙酸和苯乙酸，并进一步转化为苯乙醇、苯乙醛、苯乙酸乙酯等产物[10]；(2)在酪氨酸解氨酶和苯丙氨酸解氨酶的作用下生成对香豆酸，随后转化为多种次级代谢产物[11]；(3)在脱羧酶作用下直接脱羧生成相应的胺化合物。

Tyr和Phe作为白酒中芳香族化合物的关键前体物质，不仅直接影响食品的口感，还会影响一系列风味物质的形成[12-13]，有必要对其含量进行合理的控制。目前，对于白酒中芳香族化合物的研究主要集中在化合物自身的定性和定量方面，对于其前体物质Tyr和Phe在白酒酿造过程中的主要生成阶段还不清楚，不同菌株、不同原料对发酵过程中Tyr和Phe含量的影响也尚未可知。

本研究通过定量检测原料中的氨基酸含量以及发酵过程中氨基酸含量的变化趋势，明确了芳香族化合物前体氨基酸的主要生成阶段，并验证了菌株和原料对于酒醅中氨基酸组成的影响，这对于白酒质量品质的提升和白酒酿造的科学化具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 菌株

所用菌株皆由本研究室自主筛选鉴定。所有菌株保藏于-80 ℃，使用前于相应培养基活化。

1.1.2 发酵样品采集

原料、糖化料、酒醅等样品取自安徽某白酒厂，对发酵过程进行跟踪取样。所有样品于-20 ℃保存。

1.1.3 试剂

酵母膏、蛋白胨购自Oxoid公司；其他试剂均购自国药集团化学试剂(北京)有限公司。

1.1.4 培养基

LB培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 10；

YPD培养基(g/L)：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20；

PDA培养基：称取37 g成品PDA培养基，加入1 000 mL蒸馏水，121 ℃灭菌20 min。

脱脂乳培养基(g/L)：脱脂乳10，蛋白胨5，酵母膏2.5，淀粉10，KH2PO 0.3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1，115 ℃灭菌30 min。

固态发酵培养基(g/L)：高粱、玉米、大米、糯米、小麦等原料用温水浸泡(玉米40～60 ℃浸泡4 h，高粱70～80 ℃浸泡18 h，糯米、大米、小麦70～80 ℃浸泡2 h)；沥干后调整含水量至大约50%，每瓶45 g分装到250 mL三角瓶，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器和设备

安捷伦液相色谱仪1100,美国Agilent公司；ODS HYPERSIL色谱柱,美国Thermo Fisher Scientific公司；Milli-Q超纯水系统,美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料和发酵过程中氨基酸含量的测定

样品的预处理：精确称取5 g样品(颗粒状原料需预先粉碎至粉状)至25 mL容量瓶，记录重量，用50 g/L的三氯乙酸溶液定容。静置1 h后过双层滤纸，随后取1 mL上清，12 000 r/min离心10 min。取400 μL上清加入液相小瓶，待测。

氨基酸含量的测定：参考张庄英等[14]的方法，采用柱前衍生化高效液相色谱紫外检测器测定氨基酸含量。

1.3.2 微生物对蛋白质水解能力的比较

采用水解圈法进行测定。将菌株从甘油管划线活化后，用接种环挑取单菌落或菌丝点于脱脂乳培养基上，细菌于30 ℃培养24 h，酵母和霉菌37℃培养72 h，随后测量水解圈直径D和菌落直径d，并计算水解圈直径与菌落直径的比值D/d。

1.3.3 菌株和原料因素对氨基酸含量的影响

菌株活化后调整细菌数/霉菌孢子数至107～108个/mL并接种于固态发酵培养基，接菌量5 mL； 30 ℃培养7 d，期间每隔12 h摇瓶1次。对照组接种等量生理盐水，其余操作均与实验组相同，以消除发酵起始时不同培养基中的氨基酸含量差异及发酵过程中原料的自发水解作用对实验结果的干扰。所有处理设置3个平行。发酵结束后按1.3.1测定氨基酸含量，将接种微生物的培养基中氨基酸含量减去空白对照中氨基酸含量，即为接种处理后氨基酸含量的净增长量。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中Tyr和Phe的主要生成阶段

2.1.1 不同原料中的Tyr和Phe含量

原料是白酒酿造过程中微生物生长繁殖的根本营养来源，不同酿酒原料中的营养物质含量和比例也各不相同[15-16]。测定5种常见酿酒原料自身带入发酵过程中的Tyr和Phe含量，结果如图1所示。结果表明，小麦和玉米分别贡献较多的Tyr和Phe，而高粱、大米和糯米带入发酵过程中的初始Tyr和Phe含量不足20 mg/kg。较糖化和发酵阶段的氨基酸含量而言(图2，图3)，原料带入的初始Tyr和Phe含量仅占发酵过程中Tyr和Phe含量的10%左右，表明大部分Tyr和Phe是在后续发酵过程中经微生物的水解作用生成的。

图1 不同原料中的Tyr和Phe含量Fig.1 Tyrosine and phenylalanine contents in differentraw materials

2.1.2 糖化过程中Tyr和Phe含量的变化

糖化过程是谷物原料中的淀粉等大分子物质在微生物作用下逐步水解为糖、氨基酸等小分子物质的过程，对于微生物生长必须营养物质的积累具有重要作用。由图2可知，糖化初始时的Tyr和Phe含量仅为20 mg/kg左右，经过45.5 h的微生物作用后Tyr和Phe含量分别增长了4倍和2.5倍，达到105 mg/kg和73 mg/kg，表明糖化过程中存在大量的植物蛋白被水解为氨基酸。

图2 糖化过程中Tyr和Phe含量的变化Fig.2 Changes of tyrosine and phenylalanine contentsin the process of saccharification

2.1.3 酒醅中Tyr和Phe含量的变化

正糟酒醅和双轮底酒醅中的Tyr和Phe含量具有相似的变化规律。对Tyr而言，其含量在0～25 d内由约200 mg/kg平稳增长至约500 mg/kg，25 d后则呈现缓慢下降的趋势。而Phe的含量在0～3 d迅速下降，随后呈现与Tyr相似的变化趋势。Tyr和Phe在发酵过程中的含量变化是白酒微生物消耗和生成2种氨基酸的综合反映。由图3可知，在发酵前期，酒醅中氧气含量充足，营养物质丰富，且酒醅中含有细菌、霉菌等大量具有蛋白质水解能力的微生物[17]，谷物蛋白被水解生成Tyr和Phe的速率大于菌体对2种氨基酸的消耗速率，从而导致2种氨基酸含量的迅速升高。而在发酵后期，氧气逐渐耗尽，好氧微生物减少，厌氧微生物逐渐占据主导地位，但厌氧微生物对蛋白质的水解能力差，使得相应氨基酸含量因菌体消耗而逐渐下降。结合图2可知，发酵起始与糖化结束时的氨基酸含量具有很大差异，这是由于混料时大曲带入了大量的氨基酸。而Phe含量在发酵初期迅速下降则可能是由Tyr和Phe代谢途径的差异引起微生物对2种氨基酸具有不同的的生成和消耗速率所造成的。

A-正糟酒醅中Tyr和Phe含量的变化；B-双轮底酒醅中Tyr和Phe含量的变化图3 发酵过程酒醅中Tyr和Phe含量的变化Fig.3 Changes of tyrosine and phenylalanine contents infermentation process

综上所述，在原料糖化的48 h内，Tyr和Phe含量由约20 mg/kg分别增长至105 mg/kg和73 mg/kg，在入池发酵的0～25 d内正糟酒醅中的Tyr含量由225 mg/kg增长至497 mg/kg，Phe含量在6～25 d内由480 mg/kg增长至约805 mg/kg，双轮底酒醅中Tyr和Phe在相应时期也实现了不同程度的增长。这表明糖化阶段和入池发酵的前期阶段是白酒酿造过程中Tyr和Phe的主要生成阶段。

2.2 菌株和原料因素对氨基酸含量的影响

2.2.1 白酒微生物对蛋白质水解能力的初步比较

由于体内酶系的不同和营养需求的差异，不同微生物之间对蛋白质的水解能力具有很大的差别。当能够水解蛋白质的微生物在脱脂乳培养基上生长时，菌株所产的蛋白酶能够水解培养基中的脱脂乳粉蛋白，使原本不透明的脱脂乳培养基变得透明，从而产生透明圈。D/d值反映了菌体对蛋白质水解能力的大小，表1显示了白酒酿造体系中常见的不同种属的微生物在脱脂乳培养基上的生长状况。

表1 微生物对蛋白质水解能力比较Table 1 Comparison of microbial proteolysis ability

注：ND表示未检测到菌落直径或水解圈直径。

结果表明，20株微生物中地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)对蛋白质的水解能力最强，D/d值在1.8～2.0之间，其次是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，D/d值为1.7。而乳糖短杆菌(Brevibacteriumlactosus)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)不具备水解蛋白质的能力。紫红曲霉(Monascuspurpureus)、华根霉(Rhizopuschinensis)等霉菌的D/d值在0.9～1.5之间，略低于细菌；而酵母中仅膜醭毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)和拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)具有蛋白水解能力。这一结果表明，白酒微生物中能够水解蛋白质的多数为细菌，其次为霉菌，而大部分酵母基本不具备对蛋白质的水解能力。

2.2.2 不同菌株和原料对氨基酸含量的影响

不同微生物之间自身酶系的差异和在不同原料上生长状况的差异，共同决定了不同微生物和原料对于氨基酸含量具有不同的影响。控制酿造过程中特定氨基酸的含量，关键是控制微生物对原料的水解作用。由2.2.1，挑取对蛋白质具有较强水解能力的Baclicuslincheniformis81、Bacillussubtilis80、BacillussubtilisJQ11、BacillusamyloliquefaciensJQ8、PichiamembranifaciensC-9和AspergilluskawachiiAKF2作为实验菌株进行固态发酵，通过比较接菌发酵过程前后培养基中氨基酸含量的变化探究菌株和原料因素对不同氨基酸含量的影响，结果如表2所示。

表2 菌株和原料因素对氨基酸含量的影响Table 2 Effect of strains and raw materials on amino acid contents

注：JQ11-Bacillussubtilis; JQ8-Bacillusamyloliquefaciens; 80-Bacillussubtilis; 81-Baclicuslincheniformis; C-9-Pichiamembranifaciens; AKF2-Aspergilluskawachii。

发酵过程中氨基酸的净增长量取决于微生物对氨基酸消耗作用和对蛋白质水解作用的相对强弱，当菌体对氨基酸的消耗速率大于菌株水解蛋白质生成氨基酸的速率时就表现为氨基酸含量的负增长。从氨基酸总量的变化来看，无论是同一原料接种不同微生物，还是同一微生物接种不同原料，发酵前后培养基中氨基酸含量的变化皆具有很大差异，这表明微生物和原料对氨基酸含量具有很大影响。总体而言，5种原料的可水解性从易到难依次为：糯米、大米、高粱、小麦和玉米，6种微生物对蛋白质的水解能力从大到小依次为JQ11、AKF2、JQ8、80、81和C-9。JQ11具有很强的蛋白酶活性，水解原料极易产生氨基酸的积累，提高该类菌的接入比例可能会导致发酵过程中氨基酸的含量上升。这与2.2.1的结果一致表明，细菌和霉菌在谷物蛋白降解为氨基酸的过程中发挥着主要作用，而酵母对谷物蛋白的降解能力相对较弱。

从Tyr和Phe含量来看，以糯米原料为底物时培养基中Tyr和Phe含量的增长要高于其他原料，混料时提高糯米所占部分的比重可能会导致发酵过程中Tyr和Phe含量的增加。同一菌株接种不同原料发酵后培养基中Tyr和Phe含量的变化具有很大差异，表明不同酿造原料之间的可水解特性不同，这与不同谷物颗粒之间结构和营养成分的差异有关[15-16]。JQ11发酵5种原料普遍产生较高含量的Tyr和Phe。80和JQ11虽然同属于Bacillussubtilis，但二者以同一种原料为底物进行发酵后培养基中氨基酸总量、Tyr含量和Phe含量的变化皆有很大差异，这表明即使同一种属的微生物对谷物蛋白的水解特性也可能大不相同。

3 结论

利用高效液相色谱测定原料、糖化料和不同发酵阶段酒醅中的氨基酸含量结果表明，原料自身带入的Tyr和Phe含量仅为发酵过程中Tyr和Phe含量的10%左右，大部分的Tyr和Phe生成于谷物原料的糖化过程和酒醅入池发酵的前期。

固态发酵实验的结果进一步表明，原料差异对发酵过程中的氨基酸总量和Tyr与Phe含量的变化均有影响。以糯米为底物进行发酵最容易生成大量的氨基酸，这说明在5种原料中糯米更易于被微生物所水解。此外，以糯米原料为底物进行发酵时Tyr和Phe含量的增长也要高于其他原料，从而更有利于芳香族化合物的生成。比较不同微生物对发酵原料的水解结果可知，JQ11对蛋白质的水解能力远大于其他菌株，白酒酿造体系中水解原料产生Tyr 和Phe的主导微生物。同一种属的微生物以同一原料为底物进行发酵，发酵后氨基酸总量和Tyr与Phe含量的变化情况具有很大差异，这说明即使是同种属的微生物，不同菌株之间对蛋白质的水解特性也可能不同。不同菌株之间对蛋白质水解特性差异的原因还有待进一步探究。