抵当汤调控深静脉血栓形成大鼠Th1/Th2信号漂移的实验研究

安 震 张 玥 张玉冬 侯光敏

（1.山东中医药大学，山东济南250014； 2.山东中医药大学附属医院周围血管病科，山东济南250014）

近年来，深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）的发病率逐年上升，随着对本病发病机制研究的不断深入，炎症在DVT中的作用越来越受到重视[1]。有学者提出DVT形成的关键事件最有可能是静脉壁的炎症[2]。炎症细胞因子作为炎症反应的关键物质，能够通过诱导组织因子的表达促进血液的高凝状态，在DVT中起着重要的作用。辅助性T细胞（Th）的两种亚型Th1和Th2细胞分别分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（INF-γ）等促炎因子和白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）等抗炎因子，这些因子的失衡导致Th1/Th2的漂移，从而导致疾病进展。本研究以动物实验为基础，从分子生物学的角度探讨Th1/Th2在DVT中的变化规律以及中药抵当汤的干预作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠120只，12周龄，体重200～250g，清洁级，购自山东大学动物实验中心（许可证号：SCXK鲁20130009）。1.2 实验药物 抵当汤的四味药物均购于山东中医药大学附属医院，依据《伤寒论》记载的剂量，折算后大黄45g、炒水蛭40g、炒虻虫10g、桃仁6g。汤液浓缩后折算药物浓度为2g/mL，4℃冰箱储存备用。

1.3 实 验 试 剂 TNF-α、IL-4和IL-10的 大 鼠 放免试剂盒，北京普尔伟业生物科技有限公司；大鼠IFN-γ ELISA试剂盒，R&D进口分装，上海门碟塔生物有限公司；水合氯醛，上海化学试剂采购供应站分装厂。

1.4 实验仪器 DDL-5冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；SN-695型智能放射免疫γ测量仪，上海核所日环光电仪器有限公司；WT11001R型电子天平，江苏省常州市万得天平仪器厂。

2 实验方法

2.1 模型制备 采用Rryers法[3]。用10%的水合氯醛按3mL/kg体重腹腔麻醉后，动物取仰卧位，腹中部皮肤去毛，碘伏消毒2遍，铺无菌巾。做剑突下腹正中切口，长6cm，将腹腔肠管移出体外，用湿纱布包裹后置于右腹部。打开后腹膜，仔细游离左肾静脉与下腔静脉汇合处，用4#外科非吸收性丝线于左肾静脉下方结扎下腔静脉，1#外科非吸收性丝线结扎左肾静脉水平以远下腔静脉段的主要属支，将外置肠管回纳腹腔，1#丝线缝合腹壁和皮肤，给予腹腔注射青霉素10万单位/只，4h后成功建立DVT大鼠模型。此法一般在结扎后3h血栓形成率为60%～80%，结扎后6h血栓形成率为100%[3]。课题组前期在进行预实验时，采用Rryers法造模4h后肉眼下均发现有血栓形成。

2.2 分组与给药 将120只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、抵当汤小剂量组和抵当汤大剂量组，每组30只。各组大鼠又分别按照术后第1、3、7日处死时间的不同随机平均分笼饲养，每笼10只。假手术组按照下腔静脉造模术的方法分离出下腔静脉后，不予以结扎，而后关腹。术后4h开始每日给药。假手术组和模型组给予生理盐水灌胃，每日1mL/100g，1次/d；抵当汤大、小剂量组分别每日予1.8、0.9g/100g药液灌胃，1次/d。

2.3 取材 分别于术后第1、3、7日取相应笼中的大鼠，最后一次灌胃2h后，腹腔麻醉，开腹，操作同造模方法，腹主动脉取血，立即置于不加抗凝剂的试管内，于30min内送核医学科离心后保存待测。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 血清TNF-α、IL-4、IL-10 取腹主动脉血2mL，注入普通塑料试管内，4℃、离心半径17.8cm、3000r/min离 心10min，离 心 血清，-20℃保存备用。测定前使样本置于室温或冷水中复融，再次4℃、离心半径17.8cm、3000r/min离心5min，取上清液测定。

2.4.2 血浆IFN-γ 取腹主动脉血2mL，注入含EDTA的试管内，离心半径17.8cm、3000r/min离心30min去除颗粒，-20℃保存备用。测定前至室温中复融，采用固相夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）测定。

2.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。数据资料用（±s）形式表示，采用t检验，多组间比较用方差分析，组间两两比较用q检验。P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异。

3 实验结果

实验过程中各组大鼠均有因麻醉过量、相互咬伤、手术操作不当以及其他原因而未能获得标本就已经死亡的情况，剩余只数见表1、表2。

表1 各组大鼠干预各时期血清TNF-α、IL-4、IL-10，血浆IFN-γ水平比较（±s）

表1 各组大鼠干预各时期血清TNF-α、IL-4、IL-10，血浆IFN-γ水平比较（±s）

注： 与假手术组比较，**P＜0.01 ；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 ；与抵当汤大剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与本组术后第1日比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与本组术后第3日比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

组别 时间 动物数（只） T N F-α（n g/m L） I F N-γ（p g/m L） I L-4（p g/m L） I L-1 0（n g/m L）假手术组术后第1日 1 0 1.5 7±0.1 4 2 1 6.1 6±0.4 1 2 4 4 6.1 3±6.6 4 0 2 9.6 7±2.1 8 6术后第3日 9 1.6 0±0.1 5 6 1 7.9 6±1.5 3 1 4 5 1.6 1±8.0 3 5 3 1.4 2±1.4 8 1术后第7日 9 1.5 2±0.0 9 8 1 6.5 6±0.9 3 9 4 5 8.4 4±1 1.1 8 9 3 3.4 8±1.5 9 2模型组术后第1日 9 2.1 0±0.1 6 8** 2 6.8 9±1.7 8 0** 4 8 9.9 7±1 3.4 4 9** 3 6.4 3±1.3 6 6**术后第3日 9 2.4 1±0.1 4 9**## 3 4.1 7±4.4 6 2**## 5 0 4.1 2±1 0.7 6 9**# 3 8.4 1±2.0 2 1**#术后第7日 9 2.2 9±0.1 0 5**# 3 1.1 5±3.7 6 1**# 5 3 0.6 7±1 7.4 0 9**##☆☆ 4 1.7 6±2.6 6 5**##☆☆抵当汤小剂量组术后第1日 9 1.8 5±0.1 5 9▲▲ 2 2.7 5±2.2 3 5▲▲△ 5 1 8.9 1±1 1.2 3 8▲▲△△ 4 0.7 8±4.4 7 7▲术后第3日 9 2.1 6±0.1 3 7▲▲△## 2 7.2 2±2.1 4 1▲▲△## 5 4 0.7 0±8.2 5 4▲▲△ 4 1.2 6±2.1 8 6▲△△术后第7日 8 2.0 2±0.1 4 1▲▲△# 2 5.5 1±2.9 5 8▲▲△△# 5 7 4.3 6±1 8.1 8 6▲▲△△ 4 7.3 2±1.5 9 2▲▲△△##☆☆抵当汤大剂量组术后第1日 1 0 1.7 6±0.0 8 8▲▲ 2 0.7 0±1.5 1 2▲▲ 5 3 8.5 8±1 0.4 7 1▲▲ 4 2.0 5±1.0 4 8▲▲术后第3日 8 2.0 0±0.1 1 7▲▲## 2 4.9 6±2.1 1 2▲▲## 5 5 2.2 8±1 1.9 0 7▲▲# 4 9.8 5±1.9 0 7▲▲##术后第7日 8 1.8 7±0.1 1 5▲▲☆ 2 1.3 4±1.2 2 7▲▲☆☆ 6 0 5.8 1±1 1.9 3 9▲▲##☆☆ 5 1.9 7±1.6 4 8▲▲##☆

表2 各组大鼠干预各时期IL-10/TNF-α、IFN-γ/IL-4比值比较（±s）

表2 各组大鼠干预各时期IL-10/TNF-α、IFN-γ/IL-4比值比较（±s）

注： IFN-γ/IL-4比值数值过小，为了计算方便，表中数值为比值×100。与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01；与抵当汤大剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与本组术后第1日比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与本组术后第3日比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

组别 时间 动物数（只） I L-1 0/T N F-α I F N-γ/I L-4假手术组术后第1日 1 0 2 0.5 3±1.9 6 6 3.6 2±0.3 2 9术后第3日 9 1 9.6 4±1.1 8 1 3.9 8±0.3 6 7术后第7日 9 2 0.7 3±1.5 9 2 3.6 1±0.5 0 5模型组术后第1日 9 1 7.3 5±2.2 1 1** 5.4 9±0.6 3 0**术后第3日 9 1 5.9 4±0.6 9 9** 6.7 8±0.6 8 6**##术后第7日 9 1 8.2 3±1.2 8 9**☆ 5.8 7±0.6 2 1**☆☆抵当汤小剂量组术后第1日 9 2 2.0 4 3±1.7 7 8▲▲△ 3.9 9 8±0.1 7 4▲▲△△术后第3日 9 1 9.1 0 2±1.7 9 2▲▲△△ 5.0 3±0.8 9 5▲▲术后第7日 8 2 2.1 9±3.6 5 1▲▲△△☆ 4.4 4±0.7 3 6▲▲△抵当汤大剂量组术后第1日 1 0 2 3.8 7 5±1.0 5 5▲▲ 3.4 7±0.3 3 0▲▲术后第3日 8 2 4.9 3±1.3 8 2▲▲ 4.5 2±0.8 3 7▲▲#术后第7日 8 2 7.7 9±1.8 8 8▲▲☆ 3.5 2 2±0.6 9 0▲▲☆

3.1 各组大鼠干预各时期血清TNF-α、IL-4、IL-10，血浆IFN-γ水平比较 结果见表1。说明抵当汤对血栓引起的TNF-α、IFN-γ升高有抑制作用，且其作用表现出剂量依赖性；能剂量依赖性地升高IL-4、IL-10水平。各组大鼠TNF-α、IFN-γ水平随手术的天数呈现先升高而后下降的趋势，说明随着血栓的形成，细胞因子TNF-α、IFN-γ水平逐渐升高，在术后第3天达到高峰，第7天时已逐渐下降。各组IL-4、IL-10水平随手术的天数呈现逐渐升高的趋势。

3.2 各组大鼠干预各时期IL-10/TNF-α、IFN-γ/IL-4比值比较 结果见表2。

4 讨论

随着近年来分子生物学的发展，对于DVT发病机制的研究越来越深入。越来越多的研究证明炎症与DVT的发生密切相关。Th1和Th2是Mossman在1989年根据T细胞分泌因子的不同提出的两个功能亚群，Th1和Th2细胞能够分泌多种炎症细胞因子，其中Th1分泌的TNF-α、IFN-γ具有促炎作用，Th2分泌的IL-4、IL-10具有抑炎作用[5]。正常情况下，Th1/Th2在体内存在着动态平衡，当Th1/Th2平衡失调并向某一状态转化时，称之为Th1/Th2漂移现象[6]。习惯上把Th1及其细胞因子占优势的状态称为Th2向Th1漂移，反之Th2及其细胞因子占优势的状态称为Th1向Th2漂移。Th1/Th2漂移，能够影响疾病进展。本研究结果显示，血栓形成后同一时相，模型组较假手术组TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10显著升高，差异有非常显著性（P＜0.01），说明在排除手术的原因后，血栓形成能引起TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10的升高。随着天数的增加，IL-10/TNF-α比值在第3天变小，第7天增大，而IFN-γ/IL-4比值在第3天增大，第7天回落。说明血栓形成后，机体存在TNF-α、IFN-γ等促炎因子分泌增加，导致Th1占优势，Th2向Th1漂移，且在第3天达到高峰。这与DVT的临床表现相一致：发病初期，随着Th1细胞因子分泌的增加，机体的炎症反应明显，表现为肢体红肿热痛；随着病程的延长，Th2细胞因子分泌逐渐增加，下调静脉壁的炎症，表现为患肢红肿热痛减轻，血栓也趋于稳定。

DVT属于中医学“股肿”“瘀血流注”范畴，临床表现多有患肢的红、肿、热、痛，中医辨证多属瘀热互结。DVT后瘀血阻于经脉，气血运行不畅，瘀久化热，热邪又可伤津灼血，使血脉滞涩，即所谓“瘀积发热”“留瘀化火”。“血不利则为水”，瘀血阻于脉中，营血回流受阻，导致津液代谢、输布障碍，聚而为湿。瘀久化热，热邪灼津，炼液成痰。可见瘀和热不仅是DVT过程中的病理产物，还是新的致病因素[7-8]。因此中医治疗当以泻热逐瘀为主要治法。抵当汤出自《伤寒杂病论》，由水蛭、虻虫、桃仁、大黄四味药物组成，是治疗下焦蓄血证的经典方剂。方中水蛭逐恶血破癥，具有破瘀血而不伤新血，专入血分而不伤气分的特点；虻虫入肝经而专破瘀血；辅以活血祛瘀的桃仁，下瘀泻热的大黄，使瘀热从下窍而泄。本研究结果显示，抵当汤治疗后TNF-α、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值较模型组降低，IL-4、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值较模型组升高，且抵当汤大剂量组的作用强于小剂量组。说明抵当汤能剂量依赖性促进Th2细胞因子的分泌，抑制Th1细胞因子分泌，使Th2向Th1漂移的状态得到遏制和逆转。

综上所述，本研究观察了Th1和Th2在DVT中的比例变化及其特征性炎症因子的表达。DVT存在Th1细胞因子分泌占优势，Th2向Th1漂移的现象。抵当汤能剂量依赖性诱导Th2细胞因子的分泌，抑制Th1细胞因子表达，调节Th1/Th2平衡，减轻炎症反应，达到治疗DVT的目的。下一步我们将通过研究Th1/Th2漂移调节机制，控制其分化的细胞因子微环境，进而调节体内Th1/Th2漂移，最终实现控制炎症，达到防治DVT的目的。