橘皮素通过抑制Notch信号通路干预小鼠肝纤维化进程

罗 辉， 孔 瑞， 王 楠， 卢 洁

(同济大学附属第十人民医院消化内科，上海 200072)

肝纤维化是常见的慢性可逆性肝病，是肝硬化甚至原发性肝癌进展前期阶段。目前已有研究表明，肝纤维化过程存在多项病理改变，包括汇管区放射状排列结构改变，隔板形成；小叶中心静脉壁增厚及肝窦周纤维化；门管区炎症、碎片状坏死及脂肪变等。除此之外，已证实多种类型细胞激活包括肝星状细胞、肌成纤维细胞、成纤维细胞等参与细胞外基质形成及胶原沉积；多个细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β及氧化应激产物等也参与肝纤维化过程。有研究表明，Notch信号通路协同TGF-β1/smads信号通路“cross talk”作用与肝纤维化过程中肝星状细胞激活及免疫调节密切相关。

橘皮素是从果实橘皮中提取得到的天然产物，目前研究表明该药作为Notch通路抑制剂具有保护神经、防治肾衰、抑制氧化应激，拮抗炎症反应等作用。Yuan等证明，在大鼠慢性肝病模型中，同时服用橘皮素可以增强水飞蓟素生物活性发挥抗炎保肝作用。本研究应用胆总管结扎术创建胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型，探讨橘皮素通过抑制Notch信号通路对治疗肝纤维的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

橘皮素(化合物纯度达99.7%)购自Target Molecule公司，天狼猩红染色试剂盒购自Abcam公司，Masson染色试剂盒购自杰美生物公司，小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司，透明质酸(HA)和层粘连蛋白(LN)ELISA检测试剂盒购自Cusabio公司，羟脯氨酸(Hyp)检测试剂盒购自南京建成公司，全细胞及组织蛋白提取试剂盒购自苏州新赛美生物公司，Tris碱、SDS、甘氨酸、甲醇、硝酸纤维素膜(NC膜)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)及二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定凝胶试剂盒购自上海碧云天公司，TRIzol、二乙基焦碳酸酯(DEPC)水、氯仿、异丙醇、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司，兔抗鼠RBPJ一抗、兔抗鼠Hes1一抗、兔抗鼠Notch1一抗、兔抗鼠TGF-β1一抗，兔抗鼠smad2一抗、兔抗鼠smad3一抗(Cell Signaling Technology公司)，兔抗鼠Hey1一抗(Proteintech公司)。

1.2 动物模型建立

将45只体质量22～25g的8周龄C57BL/6J小鼠随机分为4组： 假手术组(10只)、胆总管结扎手术(BDL)组(15只)、橘皮素治疗组(10只)及单纯橘皮素用药组(10只)。小鼠行BDL术前禁食24h，用0.1mL的1%戊巴比妥腹腔注射麻醉后行开腹操作，台式动物手术显微镜下寻找小鼠胆总管，用8-0丝线结扎2次，于两结扎点之间剪断胆总管防止再通；手术过程中可向腹腔中滴注适量含抗生素的生理盐水，结扎后逐层关腹，术后注意保暖及观察小鼠状态。假手术组术前准备及麻醉同BDL模型组及橘皮素治疗组，开腹后直接关腹，无需结扎胆总管。橘皮素治疗组建模10d后开始以100mg/kg橘皮素灌胃治疗，每天1次，共20d。单纯橘皮素用药组无需手术，与橘皮素治疗组同时进行同剂量橘皮素灌胃。各组小鼠模型建立30d后采血处死，留取肝组织进行进一步实验。本实验药物应用剂量参考预实验结果及相关文献。

1.3 方法

1.3.1 小鼠肝脏H-E染色、Msaaon染色、天狼星红染色 剪取小鼠新鲜肝脏组织约1cm×1cm×0.3cm大小，4%多聚甲醛固定过夜后依次浸入梯度浓度酒精脱水，二甲苯透明、石蜡包埋，切片约4μm厚；石蜡烤片60℃ 2h，二甲苯脱蜡，梯度酒精复水后应用H-E染料进行常规染色；光学显微镜下观察拍照，由2位病理科医师独立进行病理学分析,观察镜下视野中小鼠肝脏组织炎症与纤维化程度，纤维化评估采用Ishak评分中纤维化评分；每只小鼠肝组织非连续切片至少3张，每张H-E切片至少观测5个镜下视野进行肝纤维化程度评估计分，取其均值。

石蜡切片常规处理后进行Masson染色或天狼星红染色，光镜下观察拍照，对胶原沉积阳性表达区域用Image J软件进行计算，每张切片至少观察5个视野并用软件计算得出阳性染色面积所占总染色组织面积的百分比。

1.3.2 小鼠血清肝功能指标ALT、AST及肝纤维化指标LN、HA检测 0.1mL 1%戊巴比妥麻醉小鼠后摘取眼球取血，4℃冰箱放置2h，3000r/min，离心半径12cm，离心10min，将血清吸取至新1.5mL离心管中。按照ELISA试剂盒说明书进行常规包被封闭，加样、抗体结合，加酶结合物，结果测定及绘制标准曲线计算ALT、AST、LN、HA样本浓度。

1.3.3 小鼠肝脏组织Hyp含量测定 称取6～12mg新鲜小鼠肝脏组织制成匀浆，调节pH至中性，取上清，按照说明书配制反应液进行操作，3500r/min离心10min后取上清样本于酶标仪550nm检测吸光度值，计算组织中Hyp含量。

1.3.4 免疫组织化学检测肝组织中相应基因蛋白表达情况 石蜡切片60℃烤片2h，二甲苯脱蜡，梯度酒精复水后抗原修复，一抗染色过夜后二抗孵育，DAB显色后中性树胶封片，显微镜下观察拍照，对棕色染色区进行统计学分析。

1.3.5 荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR) 剪取适量小鼠新鲜肝组织，使用组织研磨棒研磨均匀后应用TRIzol提取组织RNA，RNA有效浓度稀释至500ng/mL，反转录得到cDNA后用于荧光定量PCR反应，根据ΔΔCt值对Notch信号通路上关键基因表达量变化进行统计学分析。本实验所用引物见表1。

1.3.6 Western印迹法 使用组织裂解液及磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合液提取新鲜肝组织蛋白(按说明书比例配制1∶100)，BCA法蛋白定量后上样，电泳跑胶分离蛋白；使用NC膜转膜后牛奶封闭至少1h，相应条带各自4℃孵育一抗过夜，浓度分别为Notch1(1∶500)、RBPJ(1∶1000)、Hes1(1∶1000)、Hey1(1∶500)、β-actin(1∶1000)，经洗膜液清洗后，室温孵育二抗1h，经Odyssey双色红外激光成像系统检测目的蛋白表达量。

表1 各基因检测引物序列

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 肝脏大体形态及病理学评分

造模30d后，与假手术组相比，BDL模型组小鼠面部、颈部等处皮肤明显黄染，肝脏肉眼可见分布均匀小结节，胆囊明显增大；说明本实验造模成功，见图1。H-E染色发现，BDL模型组小鼠镜下可见肝小叶排列紊乱，肝板内肝细胞气球样变性及出现嗜酸性星状肝细胞，小叶中心静脉壁增厚及肝窦周纤维化；多处小胆管增生，胆管上皮有淋巴细胞出现；淋巴细胞浸润及淋巴滤泡增生。橘皮素治疗组纤维化程度较轻，可见汇管区肿大但少见隔板形成，淋巴细胞浸润及滤泡增生较少见，门管区炎症较轻，纤维化评分低于BDL模型组(P<0.05)。假手术组及橘皮素单纯用药组病理形态无明显改变。

图1 胆汁淤积性肝纤维化小鼠大体图及离体肝脏Fig.1 The liver tissues from mice modelA： 左为BDL模型小鼠，右为假手术组小鼠；B： 正常小鼠肝脏；C： BDL模型小鼠肝脏，胆囊中胆汁已释放

2.2 小鼠组织Masson染色及天狼星红染色

Masson染色可见橘皮素治疗组较BDL模型组胶原沉积明显减少，胶原纤维阳性染色为深蓝色。Image J结果显示橘皮素治疗组蓝染面积占比为21.04%±4.89%，BDL模型组为42.43%±7.03%(t=7.50,P<0.05)；天狼猩红染色可见Ⅰ型胶原纤维沉积，实验阳性结果为红色，见图2，橘皮素治疗组Ⅰ型胶原沉积占比为7.78%±0.49%，BDL模型组为2.94%±0.15%(t=28.44,P<0.05)。

2.3 小鼠血清ALT、AST、HA、LN结果

橘皮素药物治疗组血清ALT、AST、HA、LN水平均显著低于BDL模型组，差异均有统计学意义，具体数据分析见表2。

图2 各组小鼠肝组织病理评估Fig.2 The effect of tangeretin on liver pathological changesA： 苏木精伊红染色，显示橘皮素应用后肝脏假小叶形成减少，炎症细胞浸润减少；B： Masson染色，橘皮素应用可减少胶原纤维沉积，即蓝色着色面积减少；C： 天狼星红染色，橘皮素应用可减少胶原纤维沉积，即橘红色着色面积减少

2.4 小鼠组织Hyp含量测定

同BDL模型组相比，橘皮素治疗组Hyp含量明显降低，两组差异有统计学意义[(184±42) μg/g比(113±16) μg/g，t=4.72，P<0.05]。

表2各组小鼠血清ALT、AST、HA、LN水平比较

组别nALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)HA/(μg·L-1)LN/(ng·mL-1)假手术组1025.58±3.0834.82±2.06343.62±4.071.97±0.31BDL模型组151219.00±47.89∗967.50±27.71262.80±38.1539.29±5.15橘皮素治疗组1062.46±8.91∗#231.70±72.6768.11±8.556.62±0.86橘皮素单纯用药组1027.56±3.1141.50±3.38948.97±5.702.21±0.42F241.9570.128.0447.02

HA: Hyaluronic acid透明质酸；LN: Laminin层粘连蛋白；ALT: Alanine aminotransferase谷氨酸转氨酶；AST: Aspartate aminotransferase谷草转氨酶；与假手术组比较，*P<0.05；与BDL模型组比较，#P<0.05

2.5 Notch信号通路各组分表达量变化测定

与BDL模型组相比，橘皮素治疗组Notch1、RBPJ、Hes1及Hey1蛋白表达量均明显降低，见图3。荧光定量PCR实验结果与蛋白质印迹结果一致，两组Notch1、RBPJ、Hes1及Hey1基因表达水平差异亦均有统计学意义(t=8.41、6.14、1.70、3.42，均P<0.05)，见表3。

小鼠组织石蜡包埋后切片，烤片后分别应用Notch1, RBPJ, Hes1及Hey1一抗染色，显微镜下观察阳性着色率，与BDL模型组比较，橘皮素治疗组阳性着色率明显降低，见图4。

图3 各组小鼠肝组织中Notch信号通路组分蛋白表达量Fig.3 The protein level of Notch signal in liver tissuesWestern印迹法分析各组小鼠肝组织中Notch信号通路表达量，通路中关键基因Notch1, RBPJ, Hes1, Hey1 表达量明显被橘皮素抑制

图4 小鼠肝组织Notch1, RBPJ, Hes1, Hey1表达免疫组化图Fig.4 Effect of tangeretin on the Notch signalpathway in liver fibrosis应用橘皮素治疗后肝组织Notch1, RBPJ, Hes1, Hey1棕色阳性细胞染色区域较BDL组明显减少(×200)

2.6 橘皮素通过TGF-β1/smads信号通路对肝纤维化的调节作用

免疫组化结果显示，与BDL模型组比较，橘皮素治疗组小鼠肝组织TGF-β1、smad2及smad3阳性着色率(棕色细胞染色区域)均明显降低，见图5。

图5 小鼠肝组织TGF-β1, smad2/3表达免疫组化图Fig.5 Effect of tangeretin on the TGF-β1/smadspathway in liver fibrosis(×200)

组别nNotch1RBPJHes1Hey1假手术组101.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00BDL模型组153.84±0.306.02±0.472.44±0.6030.66±8.19橘皮素治疗组101.17±0.121.81±0.501.37±0.192.62±0.49单纯用药组100.92±0.0641.27±0.240.86±0.111.35±0.19F75.6442.004.9812.53

3 讨 论

临床上，在肝纤维化阶段，患者并无明显症状，发展为肝硬化失代偿期才会出现相应的临床表现，检查结果常表现为肝酶升高及肝纤维化指标异常等。肝移植是根治肝纤维化的有效手段[10]，但临床实施存在多方面限制。目前临床医师主要通过治疗原发病、减少炎症和宿主免疫反应及抑制星状细胞活化等方面减缓肝纤维化的进展[11]，但由于常用药物副作用及耐药性的产生，效果并不理想。近年来，随着单药及有效单体研究的发展，雷公藤红素、红景天苷等药物逐步进入临床并应用于肝纤维化治疗[12]。

本研究通过橘皮素灌胃治疗胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型，发现橘皮素治疗组小鼠皮肤黏膜黄染程度明显低于BDL模型组，而Masson染色及天狼星红染色结果说明橘皮素可减少纤维化胶原沉积，H-E染色显示橘皮素干预后肝纤维化病理学评分降低。血清中ALT及AST在一定程度上反映肝损害程度，橘皮素治疗组肝酶指标与BDL组相比明显降低。常用肝纤维化检测指标有Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、LN、HA，本研究选取LN和HA来衡量肝纤维化程度，橘皮素治疗组血清中LN、HA含量明显低于BDL模型组，结果证实橘皮素对肝纤维化进展具有一定减缓作用。

在胆汁淤积性纤维化过程中，激活的肝星状细胞可转化为肌成纤维细胞，并释放大量TGF-β1，其促进纤维化过程中胶原沉积及细胞外基质生成，并促进位于胞质内下游因子smad2/3的表达[14-15]。本研究结果提示，橘皮素药物干预可明显降低BDL所致胆汁淤积性肝纤维化组织中TGF-β1及其下游通路组分smad2/3的表达。

Notch信号通路是一条高度保守的信号通路，其由配体(Delta1、Delta2、Jagged1、Jagged2等，受体Notch1-4、转录调节因子RBPJ)，靶基因(Hes1、Hey1)等组分构成[16]。有报道称，Notch信号通路通过影响肝脏祖细胞向胆管上皮细胞分化过程参与胆汁淤积性肝纤维化形成，并且不同组分在疾病进展过程中发挥不同作用[17-18]。陈川宁[20]研究表明，在乙醛激活肝星状细胞中，Notch信号通路“串话”TGF-β通路对肝纤维化进程具有促进作用。本研究结果进一步表明，橘皮素治疗组较BDL模型组Notch信号通路组分Notch1、Hes1、Hey1、RBPJ表达量均有不同程度降低，同时TGF-β1、smads表达量也有不同程度降低，说明该药可通过下调肝细胞中Notch信号通路延缓肝纤维化进展及肝星状细胞激活，但其具体机制仍有待深入研究。