灵芝总三萜提取与精制工艺优选*

段晓颖，范梨颖，马秋莹，牛晓静，郭 娇，徐立然

(1.河南中医药大学第一附属医院 ，河南 郑州 450000； 2.河南中医药大学，河南 郑州 450046； 3.商丘市中医院，河南 商丘 476000)

灵芝为多孔菌科灵芝属，又称瑞草、灵芝草，是灵芝属药食两用真菌，在我国已有2 000多年的药用历史，有补气安神、止咳平喘的疗效，常用于心神不宁、失眠心悸、肺虚咳喘、虚劳短气等。此外，大量临床应用表明灵芝还有抗肿瘤，保肝解毒，防治高血脂、中风、心血管疾病，抗衰老，抗神经衰弱等功效[1-5]。研究表明：灵芝能够刺激机体中淋巴细胞的转化能力和吞噬细胞的吞噬能力，从而产生免疫调节作用[6-7]。本研究以灵芝中总三萜和灵芝酸A为考察指标，通过均匀设计和单因素实验研究总三萜的最佳提取、纯化工艺。

1 药品、试剂与仪器

灵芝药材，批号140203，产地安徽。熊果酸，纯度为HPLC≥98%，中国食品药品检定研究院提供，批号110742-200517；灵芝酸A，纯度为HPLC≥98%，成都普菲德生物技术有限公司产品，批号140324；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。大孔吸附树脂HPD400，沧州宝恩化工有限公司产品；Aglient 1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司产品；TU-1800PC紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；RE-5220旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；LXJ-ⅡB离心机，上海安亭科学仪器厂产品；HK 250科导台式超声波清洗器，上海汉克科学仪器有限公司产品；Sartorius CP225D电子天平，德国赛多利斯公司产品。

2 方法与结果

2.1 灵芝总三萜提取工艺研究

2.1.1 灵芝酸A含量测定方法研究

色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A) 、0.2%磷酸水(B)，检测波长 254 nm，柱温 30 ℃，进样量 10μL，流速 1.0 mL/min，信号采集时间 90 min。梯度洗脱程序为: 0-30 min, 33%～34% A；30-60 min, 34%～80% A；60-70 min, 80%～100% A；70-75 min, 100%～33% A；75-90 min， 33% A。

对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A对照品 10.06 mg，加甲醇稀释至10 mL，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取灵芝粉末1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入乙醇 50 mL,称定质量。回流提取 60 min，放冷后称量，乙醇补足差重。滤过，取续滤液，即得。

灵芝酸A标准曲线的绘制：精密量取质量分数为1.006 g/L的对照品储备液0.05,0.10,0.25,0.50,0.75,1.00,1.25 mL置于5 mL 的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按照上述色谱条件进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量(μL)为横坐标绘制标准曲线。经计算得回归方程为y=900.76x+5.073 0,r=0.999 7。结果表明：灵芝酸A峰面积和含量在0.100 6～2.515 0 μg范围内呈良好的线性关系。

含量测定：取供试品和对照品各10 μL按色谱条件进样，记录各样品中灵芝酸A峰面积，计算灵芝酸A百分含量。

2.1.2 总三萜含量测定

参照2015版《中国药典》。

对照品溶液的制备：精密称取熊果酸对照品2.13 mg，加无水乙醇稀释至10 mL，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取灵芝粉末约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入乙醇50 mL, 称定质量；回流提取 60 min，放冷后称量质量；乙醇补足减失质量；滤过，取续滤液，即得。

熊果酸标准曲线的绘制：分别精密量取对照品溶液0.2 ，0.3，0.4，0.6，0.8 mL，置10 mL的具塞试管中；水浴蒸干；加 0.4 mL质量分数为50 g/L 香草醛-冰乙酸溶液和1.0 mL的高氯酸溶液，摇匀；65 ℃水浴 45 min；取出，立即放入冰水浴中；加入5.0 mL 冰乙酸溶液，摇匀后放置；15 min后以相应试剂为空白，在 548 nm 处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，熊果酸浓度为横坐标绘制标准曲线。经计算得回归方程为：Y=30.009X+0.099 6,r=0.999 5。结果表明：吸光度和熊果酸在0.006 7～0.026 6 g/L范围内呈良好的线性关系。

含量测定：精密量取供试品溶液 0.5 mL，同对照品的测定方法测定吸光度，根据标准曲线计算总三萜含量。

2.1.3 灵芝提取次数考察

准确称取灵芝粉末 30.0 g，加入10倍量体积分数为 850 mL /L的乙醇，提取 3 次，每次 2 h，以总三萜转移率为指标，考察提取次数对总三萜提取量的影响。结果显示：提取1次、2次、3次,总三萜转移率依次为65.52%、75.45%、83.31%。因此选择提取次数为3次。

2.1.4 均匀实验优选提取工艺

表1 总三萜提取工艺均匀设计因素水平表

表2 总三萜提取均匀设计实验安排表及实验结果

根据指标对提取目的重要性程度，给予不同的权重系数，总三萜为0.6，灵芝酸A为0.4，再进行加权求和，综合评分以各指标的转移率来计算。利用SPSS 20.0统计软件进行回归分析，根据各回归方程的回归系数、F值及其显著性检验，选出最优方程：Y=74.052+0.216X1-0.026X1X2+0.001X1X3+0.014X2X3-0.001X3。显著水平P=0.004，相关系数R=0.998，调整后相关系数R=0.994。表明该回归方程拟合度良好，因素显著。对该回归方程进行规划求解，优选的最佳工艺为：加体积分数为 900 mL /L的乙醇 8 倍量，提取 100 min。

2.1.5 最佳工艺的验证

称取灵芝粗粉 3 份，每份 100 g，按照最佳提取工艺提取，测定提取液中总三萜和灵芝酸A含量，计算转移率。结果：该工艺条件下总三萜的转移率分别为91.82%、89.19%、89.49%，平均转移率为90.17%；灵芝酸A的转移率分别为86.37%、87.10%、83.73%，平均转移率为85.73%。加权处理后平均转移率为88.39%，大于规划求解推荐值84.97%，说明该提取工艺稳定性较好。

2.2 灵芝总三萜大孔树脂纯化工艺研究

2.2.1 均匀实验优选上样工艺

均匀设计因素水平表：以吸附率为考察指标，分别考察上样液质量分数(g/L)、上样流速(mL/min)、上样液pH值和径高比4个因素对总三萜纯化的影响，因素水平表见表3。

表3 总三萜纯化均匀设计因素水平表

供试液的制备：称取灵芝药材粗粉 300 g，按照上述最佳提取工艺进行提取，合并提取液，减压浓缩，用乙醇配制不同上样液，按照U9(95)均匀实验安排表进行上样，收集流出液，按 2.1.2项下方法测定吸附后溶液中总三萜含量，计算吸附率%。结果见表4。

表4 均匀设计安排表及结果

采用SPSS 20.0统计软件进行回归分析，选出最优方程为：Y=174.884-5.311X1-0.679X3-3.448X4+0.799X1X2+0.166X1X4-3.271X2X2。显著水平P=0.004，相关系数r=0.999，调整后相关系数r=0.994。表明该回归方程拟合度良好，对该方程规划求解，优选的最佳工艺为：上样液质量分数10.52 g/L，上样流速1.0 mL/min，上样液pH值为8，径高比1∶11。

2.2.2 最佳上样工艺的验证

按照上述优选出的工艺参数平行3份进行验证试验，结果吸附率分别为99.36%、99.41%、99.39%，RSD值为0.03%，表明工艺稳定性良好。

2.2.3 泄露曲线

取已处理好的HPD-400大孔吸附树脂湿法装柱，使径高比为1∶11，取质量分数为10.52 g/L，pH=8的上样液上样，控制上样流速为 1.0 mL/min，分段收集洗脱柱液。每 10 毫升收集1份，共收集20份，测定接收液中总三萜质量分数，以上样体积为横坐标，泄露率为纵坐标绘制泄露曲线，结果见图1。

图1 泄露曲线

从第7份接收液开始已经有总三萜泄露，但此时泄露率仅为1.98%，相对于上样量仍然很小，至第12份接收液泄露液质量分数急剧增大，因此选择泄露液浓度急剧增大前上样，即110 mL。

2.2.4 洗脱工艺优选

洗脱流速考察：按上述确定的吸附条件，取上样液分别通过3根相同的HPD-400树脂柱，进行动态吸附，用3 BV的乙酸乙酯分别以1.0 ，2.0 ，3.0 mL/min的洗脱流速进行洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总三萜含量，计算解吸率。结果见图2。

图2 总三萜纯化洗脱流速考察曲线

洗脱曲线：按照上述所确定的吸附和洗脱条件，进行上柱、吸附和洗脱，每25毫升收集 1 份，连续接取洗脱液。对每份洗脱液进行测定，以流出液体积为横坐标，以每份中总三萜的解吸率%为纵坐标，绘制洗脱曲线，结果见图3。

图3 洗脱曲线

由图3可看出，当洗脱剂用量为 150 mL时，洗脱液中总三萜解吸率已接近为零，总三萜已几乎被洗脱下来，因此确定洗脱剂用量为150 mL，即3.4 BV。

2.2.5 总三萜最佳工艺验证

按照上述筛选的工艺进行上样吸附和解吸，收集流出液，测定总三萜含量。结果显示：3次含量分别为54.80%、53.95%、55.78%，平均含量为54.84%，达到50%以上，该工艺稳定、可行。

3 讨 论

在预实验中，比较HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、X-5、HPD-BJQH、S-8树脂对灵芝三萜的纯化，结果显示：D101、 HPD-400、 AB-8、X-5这4种非极性或弱极性树脂的吸附率和比吸附量均较大。通过对该4种树脂进行静态吸附、解吸动力学考察，结果显示：HPD-400型大孔树脂的吸附率和解吸率最高，且在2 h左右达到吸附平衡，较其他树脂更早达到饱和吸附，缩短吸附时间。因此，选择HPD-400作为总三萜纯化用树脂。

在总三萜的纯化工艺研究中，大都采用水溶液进行上样吸附，而三萜属脂溶性成分，灵芝三萜提取浓缩液加水溶解后出现沉淀，不易被大孔树脂吸附，损失较大，上样液用900 mL/L乙醇配制。在选择洗脱剂时,对非极性树脂,要求采用对化合物有较好溶解度且要有较好的极性,这样可得到高浓度的洗脱液,常用的溶剂是水、低级醇、丙酮、乙酸乙酯等,由于上样吸附时采用的溶剂是 900 mL/L 乙醇,因此采用比乙醇极性低的溶剂如丙酮、乙酸乙酯进行解吸,两者都具有较好的解吸能力,但丙酮为易制毒试剂，故选择乙酸乙酯为洗脱剂进行洗脱[10-12]。