基于表观遗传学探讨消异方对子宫内膜异位症大鼠内膜细胞的防护机制*

周艳艳，付佳琳，雷 震

(1.河南省中医院妇产科，河南 郑州 450002； 2.河南中医药大学第二临床医学院，河南 郑州 450002； 3.河南省中医院中心实验室，河南 郑州 450002)

子宫内膜异位症(endometriosis, EMs)是育龄妇女的常见病,发病率10%～15%。人类对本病进行了大量的研究,用多种学说解释本病，但迄今为止没有任何一种学说能完全解释EMs的所有临床表现，确切的发病机制仍不清楚。近年来，研究发现子宫内膜异位症的发生与发展是遗传易感性与环境因素相互作用的结果，同时伴随着表观遗传学方面的改变，尤其是DNA甲基化在EMs的发病机制中得到了广泛关注[1]。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a、Mbd2是DNA甲基化的关键酶。本研究以病证结合气滞血瘀证子宫内膜异位大鼠为研究对象，观察消异方对大鼠EMs在位及异位内膜组织中DNMT1、DNMT3a、Mbd2表达水平的影响，从表观遗传学方面探讨消异方对子宫内膜细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级同种未孕成年雌性8～10周龄SD大鼠120只，体质量(200±30)g，购自河南省实验动物中心。给予标准光照周期(14 h光照、10 h黑夜)，室内温度(23±2)℃，湿度40%～50%，每笼3只，予以灭菌饲料及饮用水。该实验在河南省中医院细胞成像中心实验室完成。

1.2 药品、试剂与仪器

消异方水煎剂由河南省中医院制剂室提供。处方组成：土茯苓、土鳖虫、土贝母、鬼箭羽、大血藤、连翘、香附、黄芪、乌药。每剂中药含原生药材100 g。药物被制成低剂量、高剂量2种水煎液, 质量分数分别为1 g生药/mL、4 g生药/mL。散结镇痛胶囊，0.4g/粒，江苏康缘药业股份有限公司产品，批号Z20030127，由河南省中医院药房提供。反转录试剂盒PrimeScriptTMRT resgent Kit with gDNA Eraser (批号AI12361A)、TB GreenTMPremix Ex Taq II(批号AI21774A)，购自大连宝生物公司；Dnmt1、DNMT3a、Mbd2引物序列采用Primer 5在线软件设计，并由上海生工技术有限公司合成。赛多利斯BT25S电子精密天平，德国赛多利斯公司产品；JW-3022HR型高速冷冻离心机，安徽嘉文仪器装备有限公司产品；2400型PCR扩增仪、real-time RT-PCR仪，美国 Bio-Rad公司产品。

1.3 气滞血瘀证EMs动物模型的建立

将96只SD大鼠采用自体子宫内膜移植法造模，并于术后1周，待大鼠腹部切口基本愈合后进行气滞血瘀证模型复制[2]：①用贴有纱布的止血钳夹鼠尾，使之保持激怒争斗状态，2 min/次；②用绷带细条束缚大鼠后肢，使之行走困难，30 min/次；③食用油10 μL/g体质量灌胃；④以质量分数为1 g/L的肾上腺素皮下注射，0.2 mL/只。每日从以上方式中随机选择一种进行刺激,连续4周。

1.4 分组与给药

另取24只大鼠于清洁级环境中饲养，作为空白对照组。将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、中药低剂量组、中药高剂量组、散结镇痛胶囊组4组，每组24只。散结镇痛胶囊组灌胃给予散结镇痛胶囊(0.05 g/mL)；中药低剂量组(1 g/mL)、中药高剂量组(4 g/mL)给予消异方水煎剂；空白对照组及模型对照组大鼠均给予生理盐水，以上各组给药容积均为1 0 μL/g，2次/d，连续28 d。

1.5 检测指标

在末次给药1 d后将各组大鼠处死，快速摘取在位及异位子宫内膜，快速冻存于-80 ℃冰箱。采用RT-PCR法检测内膜组织中DNMT1、DNMT3a、Mbd2的表达，严格按照操作说明进行实验。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 DNMT1、DNMT3a、Mbd2在空白对照组、模型对照组中的表达水平的对比

与空白对照组正常内膜对比，DNMT1、DNMT3a在模型对照组异位及在位内膜呈低表达，Mbd2呈高表达，差别均有统计学意义(P<0.01)；DNMT1、DNMT3a在模型对照组异位与在位内膜的表达对比，差别无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 DNMT1、DNMT3a、Mbd2在空白对照组、模型对照组中的表达的对比

注：与空白对照组对比，***P<0.01；与模型对照组异位对比，#P>0.05

2.2 消异方对EMs大鼠异位内膜DNMT1、DNMT3a表达水平的影响

与模型对照组对比，在中药低、高剂量组和散结镇痛胶囊组的DNMT1、DNMT3a表达均升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与中药低剂量组对比，中药高剂量组的DNMT1、DNMT3a呈高表达(P<0.05)。散结镇痛胶囊组与中药低剂量组的2个指标对比，差别无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 消异方对EMs大鼠异位内膜DNMT1、DNMT3a表达水平的影响

注：与模型对照组对比，△△△P<0.01；与中药低剂量组对比，＊P>0.05，＊＊P<0.05

2.3 消异方对EMs大鼠异位内膜Mbd2表达水平的影响

与模型对照组对比，中药低、高剂量组和散结镇痛胶囊组的Mbd2表达均降低，差别有统计学意义(P<0.01)。与中药低剂量组对比，Mbd2在中药高剂量组呈低表达(P<0.05)，Mbd2在散结镇痛胶囊组与中药低剂量组表达无明显差异(P>0.05)。见表4。

表4 消异方对EMs大鼠异位内膜Mbd2表达水平的影响

注：与模型对照组对比，△△△P<0.01；与中药低剂量组对比，*P>0.05；**P<0.05

3 讨 论

子宫内膜异位症是育龄妇女的常见病，临床症状以痛经、不孕、慢性盆腔痛、盆腔包块多见。该病近年来虽被大量研究，但其发病机制仍不清楚。现有多种学说解释EMs的发病机制，如种植学说、体腔上皮化生学说、诱导学说、遗传因素、在位内膜决定论，以及其他(如自身免疫疾病等)，但没有一种学说能完全解释EMs的所有临床表现。近年来，表观遗传学，尤其是DNA甲基化在EMs的发病机制中得到广泛关注。人类肿瘤细胞中DNA甲基化的改变可以视为肿瘤生物标志之一[3-4]。EMs是良性疾病，但在临床上有类似肿瘤的生物学特性，如种植、浸润及转移等。且目前学术界研究发现[5-6]EMs可能是一种表观遗传学疾病。表观遗传修饰有DNA甲基化、组蛋白乙酰化，磷酸化等，其中DNA甲基化是最主要的一种修饰方式，为DNA复制后发生的共修饰作用。一般认为DNA甲基化与基因的表达呈反比关系[7]。甲基化程度越高，基因的表达越低，去甲基化又可使基因的表达增强。甲基化转移酶为DNA甲基化关键酶[8]。DNMT1、DNMT3a是基因甲基化的重要调节因子[9]。DNMT1定位在染色体19p13.2，其功能主要是在细胞的分裂过程中维持DNA新生链的甲基化状态与形式，维持甲基化转移酶的功能。DNMT3a定位于人染色体2p33，主要是催化DNA甲基化新生位点，在配子形成和植入后的胚胎中起建立新甲基化模式，形成甲基化转移酶的作用。此外，Mbd2是具有甲基CpG结合结构域的蛋白家族成员，可与组蛋白乙酰化酶形成复合体，抑制基因表达。目前认为Mbd蛋白可以募集组蛋白去乙酰化酶到基因组上的甲基CpG富集区，从而抑制转录[10]。消异方中土茯苓解毒清热、除湿通络，土鳖虫活血散瘀、通经止痛，两味药化瘀活血、解毒通络，共为君药。土贝母散结解毒，鬼箭羽破血通络、解毒消肿，大血藤散瘀止痛、清热消肿，连翘清热解毒、散结消肿作用，四味药助君药加强化瘀散结、清热解毒之力，共为臣药。香附具有理气解郁、止痛调经功效，性平，味辛、微苦、微甘，辛能散，微苦能降，微甘能和，为血中气药，一则行气以助化瘀，二则用在味苦药中防其凝滞。炙黄芪健脾益气，能提高免疫力。方中加入辛温之乌药，既防诸药苦寒凝滞气血，又能止痛减轻症状。此三味药共为佐使之药。综观全方补泻兼施，寒热并用，标本兼治，共奏化瘀解毒、疏肝消痈之效。

本研究结果显示：模型对照组EMs大鼠异位及在位内膜中DNMT1和DNMT3a的表达较空白对照组正常内膜明显降低，Mbd2的表达明显升高。表明：在EMS的发生过程中，DNMT1和DNMT3a的低表达、Mbd2的高表达可能会抑制了某些类似于抑癌基因作用的基因表达，从而使得子宫内膜获得了增殖、迁移和定植的能力，通过这样的机制在EMs的发病中起作用。此外，消异方的不同剂量均可以通过降低大鼠EMs内膜组织中Mbd2的表达，增强DNMT1和DNMT3a的表达来治疗EMs。EMs发生涉及到多个基因的改变,该方对其他相关基因的干预机制有待进一步研究。