抑瘤饮对胆管癌细胞增殖和凋亡的影响及机制

康晓亮，朱世高，陈述海，孙兆伟，朱呈瞻，冯玉杰，褚国庆，杨堃，张炳远

(1青岛大学附属医院，山东青岛266003；2潍坊市中医院)

胆管癌具有高转移率、高病死率的特点，是最致命的恶性肿瘤之一。目前对胆管癌最有效的治疗方法是根治性手术切除，然而大多数患者确诊时已是晚期，失去了手术机会，化疗及放疗效果也不佳，预后很差。因此迫切需要寻找新的、有效的细胞毒药物来治疗。中医药用于治疗肿瘤已取得一定成效。大量研究证实，中医药具有清热解毒、软坚散结、理气健脾、攻毒消积、益气养阴等多重功效，不仅能有效诱导肿瘤细胞凋亡，特异性杀伤肿瘤细胞，而且对正常组织和细胞的不良反应小[1]，可作为肿瘤综合性治疗措施之一。我们的前期研究显示，中药复方抑瘤饮能够在体外抑制肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭，并促进其凋亡，在动物模型中也验证了该药抑制肝肿瘤生长的功效[2]。2017年8月～2018年3月，我们观察了抑瘤饮对胆管癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨其对胆管癌的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 人胆管癌QBC939细胞来自青岛大学附属医院中心实验室。抑瘤饮组方：黄芪2 g，灵芝1 g，苦杏仁1 g，白花蛇舌草3 g，附子2 g，光果甘草2 g，西洋参1 g，桔梗1 g；均购自福建百草堂药业有限公司，由潍坊市中医院制成120 mg/mL药液，-20 ℃储存。RPMI-1640细胞培养基、青霉素和链霉素、0.25%胰酶消化液(美国Hyclone公司)，胎牛血清(以色列BI公司)；Hoechst 33258(北京索莱宝生物科技有限公司)，CCK-8凋亡检测试剂盒(广州奕源生物科技有限公司)，流式凋亡检测试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，细胞凋亡相关蛋白PARP抗体、Caspase-9抗体、Caspase-12抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体及GAPDH抗体(美国CST公司)。FACSCAI IBUR流式细胞仪(美国BD公司)，SAFIRE II-BASIC酶标仪(澳大利亚Tecan公司)；FUSION FX7活体成像分析仪(法国Vilber Lourmat公司)；IX73P2F倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 细胞培养、分组及干预 将细胞加入含RPMI-1640、10%胎牛血清、青霉素和链霉素的培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱。待细胞长满后，加入0.25%胰酶消化，以1∶2的比例传代。取对数生长期细胞，随机分为抑瘤饮低、中、高浓度组和对照组，抑瘤饮低、中、高浓度组分别加入6、8、12 mg/mL抑瘤饮，对照组加入PBS，培养24 h后进行后续实验。

1.3 细胞形态学观察 采用Hoechst 33258荧光染色。从24孔板中取出细胞爬片，PBS冲洗，甲醇固定。Hoechst 33258避光染色30 min，PBS冲洗、超纯水冲洗，抗淬灭剂封片。避光条件下，荧光显微镜下观察拍照。

1.4 细胞增殖抑制率测算 采用CCK-8法。细胞培养24 h后，向96孔板各孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h后，用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度OD值。细胞增殖抑制率=(1-实验组细胞OD值/对照组细胞OD值)×100%。用同样的方法检测培养48 h后细胞的吸光度OD值，计算细胞增殖抑制率。

1.5 细胞凋亡观察 采用流式细胞术。取培养24 h的细胞，消化、离心，用PBS冲洗2遍。每组细胞加入1×Binging buffer结合缓冲液重悬细胞至1×106/mL，分别取100 μL重悬液(1×105/mL)加入1.5 mL EP管中，再分别加入PI染液，室温避光孵育15 min，加入400 μL PBS，上流式细胞仪检测。数据采用FlowJo7.6.1软件进行处理，计算细胞凋亡率。

1.6 细胞内相关凋亡蛋白表达检测 采用Western blotting法。取培养24 h的细胞，消化、离心，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。制作10%的SDS-聚丙烯凝胶，蛋白样品按20 μL的体系上样，经电泳、转膜、封闭后，分别加入兔抗PARP多克隆抗体、鼠抗Caspase-9单克隆抗体、兔抗Caspase-12多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体和兔抗GAPDH单克隆抗体，孵育过夜。采用Vilber Fusion FX7成像系统显影采集图像，Image J软件分析蛋白条带的灰度值。

2 结果

2.1 各组细胞形态 对照组细胞核形态规则完整，核膜光滑，细胞核较大，荧光分布均匀；而抑瘤饮高浓度组细胞呈明显的形态学改变，细胞核染色质固缩，核内荧光分布不均匀，出现畸形核。

2.2 各组细胞增殖抑制率比较 抑瘤饮各浓度组细胞增殖抑制率均高于对照组，其中抑瘤饮高浓度组细胞增殖抑制率高于低、中浓度组，各组48 h时的细胞增殖抑制率高于24 h(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率比较

注：与同组24 h比较，*P<0.05；与抑瘤饮低浓度组同时点比较，#P<0.01；与抑瘤饮中浓度组同时点比较，△P<0.01。

2.3 各组细胞凋亡率比较 抑瘤饮低、中、高浓度组和对照组的细胞凋亡率分别为5.05%±0.79%、9.20%±1.12%、17.10%±1.91%、3.32%±0.73%。与对照组比较，抑瘤饮各浓度组细胞凋亡率均升高(P均<0.05)。

2.4 各组细胞凋亡相关蛋白表达比较 抑瘤饮各浓度组PARP、Caspase-9、Caspase-12、Bax蛋白表达均高于对照组，Bcl-2蛋白表达均低于对照组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组细胞凋亡相关蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01。

3 讨论

胆管癌是一种原发于不同部位胆管上皮细胞的恶性肿瘤，具有局部侵袭性和高转移率，预后差。目前对胆管癌治疗最有效的方法是根治性手术切除，然而胆管癌早期进展在很大程度上是无症状的，大多数患者确诊时已是晚期，无法行根治性手术，预后很差，总体5年生存率小于5%[3]。即使进行了完全性手术切除的患者，仍有50%以上最终发生局部复发或远处转移[4]。由于胆管癌对放疗、化疗均不敏感，目前还缺乏系统性治疗手段，其确诊后的平均生存时间仅为12个月[5]，因此迫切需要寻找新的、有效的药物来治疗胆管癌患者。大量研究表明，肿瘤的发生与肿瘤细胞增殖与凋亡的平衡失调有关，因此诱导肿瘤细胞凋亡成为治疗的新方向。我国传统医学认为，胆管癌属消化系统恶性肿瘤范畴，其恶性程度高、预后差，平均生存期短；应该采取祛邪而不伤正、扶正而不留邪的治疗原则，采用健脾益气、补气养血之法固其本，同时予以清利湿热、退黄、解毒散结、抑瘤治其标，固本祛邪，整体抑瘤，既能有效地抑杀肿瘤细胞，改善人体失调的内环境，加强机体对癌细胞的监控能力，同时诱导癌细胞自我凋亡或诱导其分化，使癌细胞在无不良反应的情况下逐步萎缩，从而能对胆管癌患者产生较好的治疗效果，达到减轻症状、延长生命的目的。

抑瘤饮是由黄芪、灵芝、苦杏仁、白花蛇舌草、附子、光果甘草、西洋参、桔梗8味中药组成的复方制剂。本研究结果显示，抑瘤饮能有效抑制胆管癌QBC939细胞的增殖；在相同时间段，随着抑瘤饮浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高；而在相同浓度的抑瘤饮时，随着作用时间的延长，细胞增殖抑制率也随之升高；说明抑瘤饮对胆管癌细胞的抑制作用具有时间和浓度依赖性。Hoechst 33258染料是一种无毒的DNA染料，可作为荧光探针与DNA结合，其能够穿透细胞膜，对活细胞的染色呈渐进性，荧光显微镜下呈均匀的蓝色荧光。而凋亡细胞的细胞膜通透性发生改变，染色体固缩，DNA发生裂解，胞核内的DNA结构发生改变，使得染料更容易与DNA结合，因此会出现染色增强的现象。本研究结果显示，与对照组比较，抑瘤饮高浓度组细胞呈明显的形态学改变，细胞核染色质固缩，核内荧光分布不均匀，出现畸形核。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡[6]，是一种有核细胞调控的生理过程，主要通过内源性DNA内切酶的激活发生的自动死亡过程，被认为是精细控制的程序性细胞死亡途径。其特点为细胞萎缩、膜起泡和DNA碎片等，造成DNA含量降低，通过流式细胞仪检测时，就会形成亚二倍体峰，根据此峰能计算出细胞凋亡率。本研究结果显示，抑瘤饮各浓度组细胞凋亡率升高，并随着药物浓度的增加，凋亡率也随之升高。大量研究证实，细胞凋亡的过程中包含着多种信号转导通路的激活。依赖于Caspase的凋亡途径包括外源信号途径和内源信号途径，后者主要以线粒体的损伤，从而激活下游的凋亡分子蛋白。为了进一步探索抑瘤饮诱导胆管癌细胞的凋亡机制，我们检测了抑瘤饮对依赖于Caspase凋亡途径的相关蛋白PARP、Caspase-9、Caspase-12、Bcl-2、Bax蛋白表达水平的影响。早期研究表明，线粒体膜的破坏和线粒体膜电位降低是氧化应激诱导的凋亡性细胞死亡的生物标记[7]。Bcl-2家族和半胱氨酸蛋白酶中的一些促凋亡和抑凋亡蛋白被认为是凋亡途径的执行者[8，9]。其中，Bcl-2和Bax是两类典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，细胞的凋亡取决于促凋亡成员和抑凋亡成员的相对浓度。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡，Bcl-2/Bax直接决定了线粒体外膜的各种通道的通透性，从而决定了细胞的生存与否[10]。再者，Caspase-12和钙蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族中的两个成员，其在调节病理性细胞死亡中发挥着重要作用；钙蛋白酶是一种位于内质网中的半胱氨酸内肽酶，其可能负责切割前体Caspase-12，从而激活Caspase-12；Caspase-12缺陷型细胞对内质网应激诱导因子具有抗性，表明Caspase-12可能参与内质网应激诱导的细胞凋亡[11～14]。Caspase-12从内质网易位至细胞质中，然后直接切割前体Caspase-9，在线粒体膜电位减少的共同作用下，Caspase-9反过来激活Caspase-3[15]，最终激活PARP因子，并随后响应抑瘤饮在胆管癌细胞中PARP蛋白表达的增高，导致细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组比较，抑瘤饮各浓度组显著上调促凋亡PARP、Caspase-9、Caspase-12、Bax蛋白，而下调抑凋亡Bcl-2蛋白。推测依赖于Caspase的内源信号凋亡途径可能是抑瘤饮介导胆管癌QBC939细胞凋亡的分子机制。

综上所述，中药复方抑瘤饮能够有效抑制体外胆管癌细胞的增殖并促进其凋亡，其凋亡通路可能是依赖于Caspase的内源信号凋亡途径。其对胆管癌的其他作用机制还有待进一步研究。

(收稿日期：2018-06-27)