玉屏风散总多糖对小鼠派氏结淋巴细胞活化及功能影响的研究

陈 刚 ， 周兆海 ， 蒋焱平 ， 梁浩钊 ， 杨 鸿 ， 白银山 ， 卢玉葵 ， 邓 桦

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院 ， 广东佛山528231)

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物 SPF级BALB/c雄性小鼠6～8周龄，体质量(20±2)g，购自广东省医学实验动物中心，动物许可证号SCXK(粤)2013-0002。

1.1.2 药物及主要试剂 将黄芪、白术和防风粉剂按质量比3∶1∶1配成玉屏风散，通过水提取，过滤加热浓缩，醇提纯，最后在低温下制成粉末状的精制玉屏风散总多糖，测定其精制多糖含量>90%，分装后于-20 ℃保存。RPMI-1640培养液(GIBCO产品，批号8118007)；胎牛血清(BI产品，批号040011A)；刀豆蛋白A(ConA,Sigma产品,批号SLBS3295V)；细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司，批号201711)；抗小鼠CD3e-Percp、CD4-FITC、CD8a-PE、CD19-PE(BD-Pharmingen产品，批号分别为5079796、6032902、2303659、0000080204)。

1.1.3 主要仪器 全自动酶标仪(广州市昊洋贸易有限公司)；BD FACSVerse流式细胞仪(BD公司)；超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司)；倒置显微镜(OLYMPUS公司)；CO2培养箱(Forma Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠小肠PPs淋巴细胞的制备 小鼠脱颈椎处死，75%酒精浸泡3 min，无菌取出小肠PPs，PBS清洗，研磨过滤，获得单细胞悬液，离心弃上清，洗涤3次，重悬细胞，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。

1.2.2 配制不同浓度YPF-P 称取YPF-P，PBS溶解完全，0.22 μm滤膜过滤，倍比稀释，制成相应浓度的YPF-P溶液，现配现用。

1.2.3 YPF-P细胞试验 细胞计数并调整细胞密度至3×106个/mL，以每孔180 μL细胞悬液加入96孔培养板中，孵育1 h后，加入5种不同浓度的YPF-P溶液(终浓度分别为8、4、2、1、0.5 mg/mL)，每孔20 μL,对照孔加PBS，均设6个复孔，培养4 h，进行MTT试验，全自动酶标仪比色(波长630 nm)，检测OD值，初步得出YPF-P对PPs淋巴细胞体外活性增强的有效浓度。

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1.2.5 YPF-P不同作用时间小鼠PPs淋巴细胞体外活性的测定 操作同1.2.3，细胞孵育1 h后，分别于0 h、12 h、20 h、24 h、28 h、36 h时加入相同浓度C1的YPF-P溶液，每孔20 μL，ConA 10 μL。设细胞对照组,均设6个复孔，之后置于培养箱中分别作用36 h、24 h、16 h、12 h、8 h、0 h。MTT试验，检测OD值，分析得出YPF-P有效浓度C1发挥最佳作用的时间点，用于后续试验。

1.2.6 PPs淋巴细胞体外培养体系中细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ含量测定 按1.2.1方法制备淋巴细胞悬液接种于96孔细胞培养板，分为对照组,ConA刺激组,YPF-P协同 ConA组(各组每孔分别加不同浓度的YPF-P 20 μL，ConA 10 μL,YPF-P终浓度分别为 1、2、4 mg/mL,ConA终浓度为 2.5 μg/mL)，每组6个复孔。于培养箱中培养24 h后，收集上清液，按照 ELISA试剂盒说明书方法操作，在酶标仪波长450 nm处，测定OD值，绘制标准曲线，计算出相应测试样品中的IL-2、IL-4、IFN-γ含量。

1.2.7 PPs淋巴细胞表型的测定 按1.2.1方法制备淋巴细胞悬液，接种于12孔板中的4个孔，每孔1.8 mL，其中3孔分别加入1、2 mg/mL和4 mg/mL的YPF-P溶液0.2 mL和ConA 0.1 mL，另外1孔加入等量PBS作为对照，于培养箱中孵育。24 h后收集悬液于离心管，离心弃上清，冷PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×107个/mL。取100 μL于一套流式管中进行荧光标记，依次加入抗小鼠CD3e-Percp 5 μL、CD4-FITC 2 μL、CD8a-PE 2.5 μL、CD19-PE 5 μL，各管混匀后室温避光孵育30 min,冷PBS洗涤2次，弃上清，200 μL的PBS重悬细胞后进行流式细胞仪检测。

1.2.8 统计学处理 试验所得数据用SPSS22.0统计学软件处理，多组间采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用LSD法。采用统计学软件Origin8.5进行作图。

2 结果

2.1 不同剂量YPF-P对小鼠PPs淋巴细胞活性的影响 由图1可见，YPF-P可增强PPs淋巴细胞的活性。与对照组相比，除0.5 mg/mL YPF-P剂量组未见显著差异外，其余各剂量组均出现极显著差异(P<0.01)。各剂量组之间比较，以2 mg/mL和4 mg/mL剂量组细胞活性最高(P<0.01)，当剂量达到8 mg/mL时，与1 mg/mL剂量组无显著差异，但明显高于0.5 mg/mL剂量组(P<0.01)。

图1 YPF-P对小鼠PPs淋巴细胞体外活性的影响(n=6)注：所标小写字母不同者表示差异显著P <0.05；大写字母不同者表示差异极显著P<0.01，下图同

2.2 YPF-P协同ConA对小鼠PPs淋巴细胞增殖活化的影响

2.2.1 YPF-P协同ConA对PPs淋巴细胞的影响 由图2可见，YPF-P能协同 ConA增强小鼠PPs淋巴细胞体外活性。与ConA刺激组相比，除0.5 mg/mL和1 mg/mL YPF-P剂量组未见显著差异外，其余各剂量组均出现极显著差异(P<0.01)。各剂量组之间比较，以2 mg/mL YPF-P剂量组细胞活性最高，且当剂量达到2 mg/mL时,与0.5 mg/mL和1 mg/mL剂量组相比差异极显著(P<0.01)，但与4 mg/mL和8 mg/mL YPF-P剂量组无显著性差异。

图2 YPF-P协同ConA对小鼠PPs淋巴细胞体外活性的影响 (n=6)

2.2.2 YPF-P协同ConA对小鼠PPs淋巴细胞增殖活化的影响 由图3可见，不同浓度的YPF-P能协同ConA促进小鼠PPs淋巴细胞体外增殖活化。与ConA刺激组相比，除0.5 mg/mL和1 mg/mL YPF-P剂量组未见显著差异外，其余各剂量组均出现显著差异，2 mg/mL YPF-P剂量组差异极显著(P<0.01)，4 mg/mL和8 mg/mL YPF-P剂量组差异显著(P<0.05)。各剂量组之间比较，以2 mg/mLYPF-P剂量组细胞增殖活化最明显，且当剂量达到2 mg/mL时,与0.5 mg/mL和1 mg/mLYPF-P剂量组相比差异显著(P<0.05)，但与4 mg/mL和8 mg/mLYPF-P剂量组无显著性差异(P>0.05)。根据上述结果，本论文选用2 mg/mL作为最佳剂量，进行YPF-P协同ConA作用的后续研究。

2.3 YPF-P不同作用时间对小鼠PPs淋巴细胞活性的影响 由图4可见，在2 mg/mL的YPF-P单独作用时，各时间点淋巴细胞活性与0 h相比，均有极显著差异(P<0.01)，16 h达到最高，并持续保持高活性至36 h。ConA协同YPF-P作用时，细胞活性在8 h极显著增强(P<0.01)，在24 h和36 h达到最高，并呈持续上升趋势。结果提示，在一定时间范围内，随YPF-P作用时间的延长，细胞活性可明显增强并保持较高活性。

图3 YPF-P协同ConA对小鼠PPs淋巴细胞体外增殖活化的影响 (n=6)

图4 不同作用时间YPF-P对小鼠PPs淋巴细胞体外增殖活化的影响 (n=6)

2.4 YPF-P对小鼠PPs淋巴细胞IL-2、IL-4、IFN-γ水平的影响 由表1可见，YPF-P能协同 ConA促进小鼠PPs淋巴细胞分泌 IL-2、IL-4、IFN-γ。ConA 刺激组 IL-2、IL-4、IFN-γ分泌水平均高于对照组，且差异显著(P<0.05)。1、2、4 mg/m L的YPF-P协同ConA均能促进小鼠PPs淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFN -γ，其分泌量均高于空白对照组和ConA刺激组，差异极显著(P<0.01)，并呈一定的量效关系。

表1 YPF-P 对小鼠PPs淋巴细胞IL-2、IL-4、IFN-γ的影响 (n=6)

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与ConA刺激组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.5 YPF-P对小鼠PPs淋巴细胞表型的影响 YPF-P作用后，小鼠PPs淋巴细胞CD3+、CD4+细胞比例上升，与对照组相比，2,4 mg/mL剂量组差异显著(P<0.05或P<0.01)；所有剂量组CD19+细胞、CD4+/CD8+细胞的比值均高于对照组(P<0.05或P<0.01)；2,4 mg/mL组CD19+/CD3+细胞的比值下降(P<0.05)。见表2。

表2 YPF-P 对小鼠PPs淋巴细胞表的影响(%) (n=6)

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

3.1 YPF-P对PPs淋巴细胞体外增殖和活化的影响 ConA是一种有丝分裂原，可促进淋巴细胞增殖活化。T、B淋巴细胞是参与机体免疫应答的主要免疫效应细胞，其体外增殖活化能力在一定程度上可以反应机体的免疫功能[8]，而PPs中含有大量的T、B淋巴细胞，所以，PPs淋巴细胞体外增殖活化反应可作为研究肠黏膜免疫功能的重要手段和指标。本试验中，YPF-P在单独作用时，对PPs淋巴细胞表现较明显的促增殖活化作用；在协同ConA作用PPs淋巴细胞后，能更加明显促进细胞的增殖活化；当2 mg/mL的YPF-P协同ConA作用时，在0～36 h时间内，随作用时间延长，细胞活性明显增强并保持较高活性，且在同一时间比无ConA协同的细胞活性高。

3.2 YPF-P对PPs淋巴细胞分泌细胞因子的影响 根据辅助性T细胞(Th)亚群细胞因子的表达机制和生理功能不同，将其分为Th1和Th2两类细胞，两者分泌不同的细胞因子分别介导细胞免疫反应和体液免疫反应[9]。IL-2主要由Th1细胞产生，主要作用是促进T淋巴细胞增殖分化，亦可作用其他免疫细胞，在机体免疫调节方面发挥重要作用，其分泌水平可反映细胞免疫功能。 IL-4主要由Th2细胞产生，是Th2细胞最特异分泌的细胞因子，主要作用B淋巴细胞，在免疫应答过程中，主要表现为对细胞免疫的抑制和对体液免疫的促进作用。IFN-γ主要由Th1细胞产生，是Th1细胞最特异分泌的细胞因子，可以增强抗原递呈细胞与T细胞的作用，能诱发IL-2受体的表达，促进T细胞增殖，从而进一步扩大免疫应答[10]。细胞因子是免疫调节的关键物质之一，对于肠道黏膜免疫显示出重要的免疫调节作用，其分泌水平是判断机体免疫功能的一个重要指标。本试验中，YPF-P协同ConA能明显促进PPs淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFN-γ，提示YPF-P对肠黏膜免疫应答的作用机制可能与细胞因子的分泌水平及细胞因子之间的相互作用有关，同时表明，YPF-P既能促进细胞免疫又能促进体液免疫。

3.3 YPF-P对PPs淋巴细胞表型的影响 PPs中含有大量的T、B及其他多种免疫细胞，CD3+和CD19+分别是T、B细胞表面特异性标记分子，其含量高低可相应反映细胞免疫反应和体液免疫反应水平。CD3+T淋巴细胞根据其表面抗原不同，分为CD4+和CD8+两类，CD4+是所有Th淋巴细胞表面的特异性标记分子，可分泌多种细胞因子并促进T、B细胞增殖分化，在机体免疫系统起重要作用；CD8+是所有细胞毒性淋巴细胞(Tc)表面的特异性标志分子，Tc代表具有杀伤靶细胞活性的细胞亚群，可反映机体的细胞毒杀伤作用和抵御、清除病原的能力，通常使用CD4+/CD8+的比值变化代表机体免疫的偏移方向[14]。本试验中，YPF-P作用后，PPs淋巴细胞中CD3+、CD19+细胞比例上升，说明YPF-P能促进T、B淋巴细胞的增殖分化，既能促进细胞免疫又能促进体液免疫，这与上述结果相符；2,4 mg/mL组CD19+/CD3+细胞的比值下降，且都低于对照组(P<0.05)，但CD19+细胞和CD3+细胞比例上升，说明一定剂量的YPF-P以促进T淋巴细胞的增殖分化为主；CD4+/CD8+细胞的比值均高于对照组(P<0.05或P<0.01)，且CD4+比例上升，CD8+比例较稳定，说明Th淋巴细胞大量增殖造成其在T淋巴细胞所占比例相应增多，表明YPF-P可以明显促进T淋巴细胞增殖，这与CD19+/CD3+细胞的比值变化结果相符，CD4+/CD8+细胞的比值升高，机体细胞免疫增强，这可能与Th淋巴细胞分泌的细胞因子介导的免疫反应及细胞因子之间的相互作用有关。

研究表明，一些中药多糖对肠道黏膜免疫系统的功能具有正向调节作用，可增强机体的免疫功能[11-12]。本试验结果显示，YPF-P能促进小鼠小肠PPs内T、B淋巴细胞的增殖活化和免疫调节作用，提高相关细胞因子的分泌量，明显增强小鼠肠黏膜免疫功能。