倒扣草水煮液和抗菌药联用对3株多重耐药大肠杆菌的体外抑菌效果研究

王莉贞 ， 黄雅鑫 ， 黄采算 ， 李 铮 ， 李 崇 ， 赖重波 ， 梁祺英 ， 张 羽 ， 司红彬

(1.广西大学动物科学技术学院 ， 广西南宁530005 ； 2.百色市右江区水产畜牧兽医局 ， 广西百色533000)

倒扣草(Achyranthes aspera L.)为苋科植物粗毛牛膝的全草。主要分布广东、广西、云南、贵州、福建、湖南、山东、江苏等地。倒扣草的种子、根、茎和叶中均有一定的药用价值。倒扣草的药用价值主要体现在利小便，清血，消毒。治红白痢疾，喉疾，跌打损伤，壮筋骨，散血，止痛，理脚气[1]。

倒扣草的种子、根、茎和叶中含有很丰富的脱皮甾酮，其中以种子中含量最高。全草含倒扣草碱 (ahyranthine) 、β-蜕皮甾酮 (β-ecdysterone) 、甜菜碱 (betaine) , 种子中主要为倒扣草皂苷A、倒扣草皂苷B，根含皂苷, 其苷元均为齐墩果酸[2]。脱皮甾酮具有促进成骨细胞增殖[3], 促进伤口愈合[4], 降血脂, 降胆固醇, 抑制血糖上升的生物活性[5]。晋军等研究发现，蜕皮甾酮可以刺激内皮细胞VEGF表达上调抑制内皮细胞凋亡，从而具有内皮细胞保护作用[6]。 齐墩果酸具有抗糖尿病、抗炎、抗肿瘤等作用[7]；齐墩果酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、结核分枝杆菌、绿脓杆菌、志贺菌、链球菌均有一定的抑菌效果[8]。

大肠杆菌是临床兽医上常见的条件致病菌。近年来，多重耐药大肠杆菌严重威胁到畜牧业的发展，同时耐超广谱β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、氟喹诺酮类等多种抗生素的超级细菌频繁报道。中药与抗生素相比具有使细菌不易产生耐药性、对动物机体的副作用小、价格低廉等优点。因此，研发中药制剂作为防控多重耐药细菌性疾病成为现在的研究热点。

倒扣草可以治疗小儿黄疸[9]、腰肌劳损[10]、与白花丹、蓖麻叶联用母牛胎衣不下[11]。倒扣草水煮液用于抗菌试验较少报道，本试验拟用倒扣草水煮液与16种常用抗菌药联用，对3株含有多重耐药基因的大肠杆菌做药敏试验及联合棋盘试验研究，对临床兽医预防多重耐药大肠杆菌病起到指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料 倒扣草全草，购自广西太华药业有限公司。抗菌药头孢噻呋钠(Ceftiofur Sodium)、阿米卡星(Amikacin)、阿莫西林(Amoxicillin)、磷霉素(Fosfomycin)、阿奇霉素(Zithromax)、利福平(Rifampin)、磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine)等16种抗菌药物用蒸馏水稀释至终浓度为6 400 μg/mL，氟苯尼考为5 120 μg/mL。营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂和伊红美蓝琼脂等，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。3株多重耐药大肠杆菌由广西大学中兽医实验室分离。

1.2 菌株的分离与鉴定 从病死鸡中分离培养大肠杆菌菌株，在普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基划线培养，并在光学显微镜下观察。选择疑似大肠杆菌菌株进行16S RNA的PCR扩增，并送生工(上海)生物科技有限公司进行测序。参照GenBank已发表的CTX-M 基因序列，设计引物如下：16S RNA-F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；16S RNA-R：5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，预期片段为908 bp。

1.3 倒扣草水煮液的制备 取倒扣草全草100 g，按照料液比1∶10加入蒸馏水、浸泡过夜。第二天小火煮沸1 h,再按照1∶8、1∶6的比例加入蒸馏水，小火煮沸1 h，将3次的滤液收集合并，减压抽滤2次，浓缩滤液至100 mL，此时倒扣草水煮液的浓度约为1 g/mL。

1.4 倒扣草与抗菌药对产CTX-M 型超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的最小抑菌浓度(MICs)的测定 采用微量肉汤二倍稀释法测定倒扣草水煮液与16种抗菌药对多重耐药大肠杆菌的最小抑菌浓度(MICs)，操作过程按照CISI标准(2010版)。

1.5 倒扣草水煮液与抗菌药对产CTX-M 型超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌联合的抑菌试验 按照96孔板纵、横2个方向分别对倒扣草水煮液和抗菌药进行倍比稀释。药物相互作用效应通过计算其最小部分抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration indices，FICI)来判断。 FICI判断标准：当FICI≤0.5，为协同效应；当0.5

2 结果与分析

2.1 形态学观察 在普通琼脂培养基上，大肠杆菌呈白色菌落；在麦康凯培养基上，呈有光泽的玫红色菌落；在伊红美蓝培养基上，呈现为有绿色金属光泽的紫黑色菌落，在光学显微镜下呈短杆状、粉红色的革兰阴性菌(见中插彩版图1、2、3)。

2.2 大肠杆菌的耐药基因型 在NCBI上使用BLAST对测序结果进行分析比对，结果显示，所扩增的片段与NCBI中大肠杆菌的16S RNA序列同源性达到90%以上，表明该菌株为大肠杆菌。

根据对大肠杆菌E1、E2、E3的药敏值、结合联合棋盘FICI值分析，选取耐药基因超广谱β-内酰胺类耐药基因CTX-MU、氟苯尼考耐药基因floR、磷霉素耐药基因fosA3三种耐药基因进行PCR扩增。扩增条件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，退火温度 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环， 72 ℃ 10 min；15 ℃ 60 min。在1%琼脂糖凝胶上电泳。4种耐药基因的引物序列见表1。结果显示大肠杆菌E1含有CTX-MU；大肠杆菌E2含有CTX-MU，floR；大肠杆菌E3含有CTX-MU基因(如图4)。

表1 耐药基因引物信息

图4 大肠杆菌E1、E2、E3的PCR扩增结果

M：Marker 2 000；泳道1、4、7：CTX-M； 泳道2、5、8：fosA3； 3、6、9：泳道floR； 10、11、12分别为基因型CTX-M、fosA3、floR的阴性对照

2.3 三株大肠杆菌对抗菌药及倒扣草水煮液的MICs及联合抑菌指数(FICI) 见表2。

根据倒扣草水煮液联合16种抗菌药对大肠杆菌的MICs及联合抑菌指数分析，可以得知：对于大肠杆菌E1，当FICI≤0.5时，倒扣草水煮液与任何西药联用时，均不表现为协同效应；当0.52时，倒扣草水煮液与左旋氧氟沙星、痢菌净、林可霉素及氟苯尼考、阿奇霉素联用时，表现为颉颃效应。

对于大肠杆菌E2, 当FICI≤0.5时，倒扣草水煮液与氟苯尼考联用时，表现为协同效应；当0.52时，倒扣草水煮液与头孢噻呋钠、环丙沙星及阿奇霉素联用时，表现为颉颃效应。

对于大肠杆菌E3, 当FICI≤0.5时，倒扣草水煮液与磷霉素、利福平联用时，表现为协同效应；当0.52时，倒扣草水煮液与环丙沙星、左旋氧氟沙星、阿米卡星联用时，表现为颉颃效应。

表2 倒扣草水煮液联合16种抗菌药对大肠杆菌E1、E2、E3的MICs及联合抑菌指数 (μg/mL)

黏杆菌素对大肠杆菌E1、E2，头孢噻肟对大肠杆菌E3具有良好的敏感性，其最小抑菌浓度(MICs)均小于1.563。根据CLSI标准(2009版)，这3种抗菌药的最小抑菌浓度(MICs)小于该抗菌药对大肠杆菌的breakpionts。

3 讨论

倒扣草对3株多重耐药大肠杆菌菌株均有一定的抑菌效果。根据倒扣草水煮液联合16种抗菌药对大肠杆菌E1、E2、E3的MICs及联合抑菌指数FICI的结果判定，以及3株大肠杆菌的耐药基因型，发现当倒扣草水煮液与β-内酰胺类抗菌药联用时对3株含CTX-MU耐药基因的大肠杆菌基本表现为无关或拮抗效应；倒扣草水煮液与利福平联用时对3株大肠杆菌表现为协同或相加作用；与氟苯尼考联用时对含有floR基因型的大肠杆菌E2呈现协同效应、对不含floR基因型的大肠杆菌E1和E3呈现拮抗或相加效应；倒扣草水提液与磷霉素联用时，对大肠杆菌E3呈现协同作用；与磺胺间甲氧嘧啶钠、阿米卡星等联用时对3株大肠杆菌均呈现无关效应。

氯霉素抗性基因floR导致大肠杆菌对氯霉素产生抗药性，主要是对氟苯尼考的抗药性[12]。，当倒扣草水煮液与氟苯尼考联用时对含有floR基因型的大肠杆菌E3呈现协同效应。 Huang D等认为齐墩果酸抗革兰阴性菌的作用机理为它破坏了细菌的细胞外膜，引起形态改变导致细菌自溶，而吴蓓蓓等证实[13]floR基因编码的蛋白位于细胞膜上。因此，认为倒扣草中的齐墩果酸可能破坏革兰阴性菌细胞膜上floR蛋白，从而与氟苯尼考联用起到协同作用，对于不含floR蛋白的大肠杆菌，齐墩果酸没有有效的作用靶点，细菌细胞膜不发生自溶，倒扣草水煮液与氟苯尼考联用则起到拮抗作用。

FosA是一种Mn2+和K+依赖的谷胱甘肽(GSH)转移酶，主要在细菌细胞质内可破坏磷霉素的环氧基团并催化谷胱甘肽(GSH)与磷霉素的1位碳原子形成化合物,引起磷霉素耐药[15]。CTX-M型耐药基因主要是由质粒介导传播的，在细菌的胞质内水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环，从而起到耐药作用[15]。fosA3和CTX-M基因编码的蛋白均不在细菌的细胞膜上，齐墩果酸在细胞膜上找不到有效的作用靶点，故磷霉素、β-内酰胺类抗生素与倒扣草水煮液联用时基本为拮抗作用。

倒扣草水煮液与部分抗菌药联用可降低部分抗菌药对多重耐药大肠杆菌的最小抑菌浓度，从而减少或降低抗菌药的使用量，延缓耐药菌的产生。