华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

范玉凤 ， 邹 敏 ， 张玉玉 ， 杨旭兵 ， 宋健兰 ， 吴发兴 , 吴家强

(1.南京农业大学动物医学院 ， 江苏南京210095 ； 2.青岛易邦生物工程有限公司 ， 山东青岛266114 ；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 山东济南250100 ； 4.中国动物卫生与流行病学中心 ， 山东青岛266032)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原，引发母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状，严重危害我国养猪业。PRRSV变异性强，GP5不仅是病毒最主要的结构蛋白，参与病毒感染后的细胞与体液免疫[1]；而且是病毒变异最高的蛋白之一，以GP5序列为研究对象可在一定程度反映PRRSV流行毒株的遗传变异情况[2]。福建、山东为华东养猪大省，本研究从两省收集临床可疑样品进行检测，通过ORF5基因的扩增和序列分析，掌握近年PRRSV在华东部分地区流行的特点，为有效防控PRRS提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品 共收集41份疑似PRRS发病猪的组织病料，每份病料主要包括脾脏、肺脏、淋巴结。其中19份病料来自山东，22份病料来自福建。

1.2 主要试剂和细胞 DMEM液体培养基，购自GIBCO公司；TRIZol LS®Reagent，购自Invitrogen公司；RT-PCR相关试剂，购自TaKaRa公司； Marc-145细胞，由中国动物卫生与流行病学中心提供。

1.3 引物设计 应用Primer5.0软件设计3对引物(见表1)分别用于PRRSV检测、HP-PRRSV-Like鉴别检测、ORF5基因扩增，由生工生物工程(上海)技术服务有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 样品检测 病料研磨冻融后取上清，按TRIZolLS©Reagent说明书提取上清液中病毒总RNA。使用引物PRRSTF/R 和HP-PRRSTF/R，均采取一步法RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定PRRSV阳性和HP-PRRSV-Like阳性。

1.5 病原分离、鉴定 取样品检测为阳性的病料上清，过滤除菌后接种Marc145细胞，37℃培养，并设正常细胞对照。出现明显细胞病变(CPE)时收获细胞，冻融离心后取上清重新接种，可见明显CPE时收获培养物，-70℃保存。一步法RT-PCR扩增ORF5全基因，凝胶电泳回收DNA送生工生物工程(上海)技术服务有限公司测序。

1.6 ORF5基因扩增和序列比对分析 参照已发表文献[4]，选取GenBank数据库中31株毒株的ORF5序列作为参考序列，用DNAStar对分离株ORF5序列比对分析，用MEGA4.0中的邻接法(Neighbor-Joining)绘制系统进化树。

2 结果

2.1 PRRSV 与HP-PRRSV-Like毒株检测 山东省的19份样品中PRRSV检出率74%(14/19)，其中HP-PRRSV-Like检出率为21% (4/19)；福建省的22份样品中PRRSV检出率56%(12/22)，其中HP-PRRSV-Like检出率42% (9/22)。见图1、2。

图1 PRRSV RT-PCR检测电泳结果

M:DNA分子质量标准; 1-13:分离株; 14:阳性对照; 15:阴性对照

图2 HP-PRRSV相关毒株检测电泳结果

M:DNA分子质量标准; 2-15:分离株; 1:阳性对照; 16:阴性对照

2.2 病毒分离鉴定 用Marc-145细胞从疑似发病猪病料中分离到16株PRRSV，10株福建毒株分别命名：FJ224、FJ1409、FJLX141109、FJLYQ、FJNP141010-2、FJNP141016、FJNY141109、FJSM141026、FJYD141109、FJFQ141016；6株山东毒株分别命名：SDFNE141017、SDZC15081、SDZC15082、SDWF1508、SDYT141023、SDJN140930i。16个分离株能致Marc-145细胞聚集、边缘模糊、视野内呈现空洞。

2.3 分离株ORF5基因扩增 16个分离株的ORF5全基因扩增产物长度773 bp，经拼接、比对，确认得到16个603 bp的分离株ORF5基因序列。

2.4 ORF5基因序列分析 16个分离株ORF5基因序列同源性为80.3%～100%。分离株与毒株Lelystad的同源性为62.8%～65.0%，与VR-2332同源性为86.3%-95.0%、与CH-1A同源性86.3%～95.0%，与JXA1同源性为84.8%～99.5%。进化树(图3)显示，6个山东分离株分布于1、5、8谱系；10个福建分离株，除FZFQ141016属于谱系3外，其余分离株全部属于谱系8。

2.5 ORF5基因推导氨基酸序列变异分析 分离株以点突变为主，未见插入突变，SDZC15081等3个毒株在第33位氨基酸发生缺失，结果见图4。ORF5的3处抗原表位中，分离株在诱饵表位(27aa～30aa)较保守；在中和表位(37aa～45aa)，变异主要集中在39aa位点；在非中和表位180aa～200aa处，同一谱系的毒株变异较一致。分离株糖基化位点(NGS)数量不等，山东分离株NGS数量为4～5个，福建分离株NGS在3～7个之间。

图3 ORF5基因遗传进化树分析

3 讨论

本研究共分离6株山东毒株、10株福建毒株，其中9个福建毒株位于谱系8，山东毒株在1、5、8谱系均有分布。表明两省PRRSV流行毒株的特点不同，山东养殖猪群流行毒株多样性明显；福建猪群以高致病毒株为主。

我国猪群流行的基因2型PRRSV基于ORF5基因，按谱系分类[4]可划分为谱系1、3、5、8。进化分析发现，属于同一谱系的分离株和参考毒株，各自组成谱系内的分支，以谱系8最为明显；同时，SDJN140923i毒株在谱系5中位于独立的分支，SDZC15081、SDZC15082毒株在谱系8中位于独立分支，与谱系内其他毒株的分支区分明显。这提示，我国各省原本存在的各谱系毒株和随猪贸易输入的毒株在感染同一猪群后，不同谱系毒株广泛的基因重组、毒株遗传物质变异共同作用[3]，导致养殖猪群的流行毒株产生新遗传特征。

图4 ORF5氨基酸序列比较分析

ORF5的编码蛋白GP5是病毒免疫原性结构蛋白，该蛋白免疫识别位点的变异可降低疫苗的交叉保护率[5]。本次分离株GP5变异以点替换突变为主，但SDZC15081等毒株出现缺失突变，可能导致蛋白抗原性增强[6]。分离株在GP5的3处抗原表位均有点突变异，由于诱饵表位在病毒感染后优先被机体识别[7]，突变可能促进病毒免疫逃避。各分离株糖基化位点数目不等，病毒可通过糖基化位点数目、位置的变化，影响抗体与病毒结合、病毒对宿主细胞的侵染力[8-9]。